[发明专利]一种相同供体来源人间充质干细胞的多批次原代分离方法

说明书

本发明公开了一种相同供体来源人间充质干细胞的多批次原代分离方法，属于细胞培养领域。本发明方法是将供体组织处理后得到1‑5mm³的供体组织小块，通过胎牛血清或人AB血清浸泡处理，然后进行常规的组织块贴壁培养。收获间充质干细胞的同时，对供体组织块进行转板连续培养，并将组织块的培养上清回收继续孵育，实现来自同一供体的人间充质干细胞的高质量、多批次稳定分离。本发明所得细胞的形态、增殖及分化能力、免疫表型在各批次间均保持不变。与传统的组织块贴壁法和酶消化法相比，本发明方法避免了临床标本资源的浪费，节省了临床环节的人力物力，还提高了间充质干细胞的分离效率和产量。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种相同供体来源人间充质干细胞的多批次原代分离方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度的自我更新和多向分化能力，不仅能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉等间质组织细胞，还具有低免疫原性和免疫抑制作用，是组织工程和细胞替代治疗、移植免疫和自身免疫性疾病等治疗的重要种子细胞。

上世纪七十年代，Friedenstein及其同事首先从骨髓中培养出了间充质干细胞。近年来，研究人员又陆续从其它组织，如脂肪、乳牙以及新生儿的脐带、胎盘、羊膜、脐带血中分离得到了MSCs。其中，新生儿的脐带组织具有富含MSCs、取材方便且无伦理争议等优点，被认为是获取MSCs的一个理想来源。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stemcells,hUC-MSCs)是区别于胚胎干细胞和成体干细胞的胎儿干细胞，是一种新的多能间质干细胞，其组织来源原始、生物性能稳定、增殖分化能力强、免疫原性低。hUC-MSCs主要存在于脐带的华通氏胶(Wharton’s jelly)及脐静脉内皮下层，可通过酶消化法和组织块贴壁法获得。

下面具体阐述现有技术中酶消化法和组织块贴壁法两种方法的具体操作步骤。

(1)酶消化法(以“单酶法”为例)

将脐带剪成约2cm长的小段，用含1％双抗的PBS缓冲液重复洗涤2-3次，除去脐带血。纵向剪开脐带，剔除三条血管。将剩余脐带组织剪成小块放进小烧杯中，用眼科剪成1-2mm³大小的组织小块。将组织小块移至内含磁力搅拌子的100ml无菌玻璃瓶中，加入终浓度为0.1％的胶原酶II，37℃水浴下持续磁力温和搅拌消化2h。加入PBS缓冲液洗涤胶原，2000rpm离心15min，弃上清、留沉淀。再加入PBS将组织悬起，用尼龙网过滤，收集细胞滤液，1000rpm离心5min，弃上清。用DMEM/F12完全培养基重悬收集的细胞，吹打均匀、计数，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱内培养。24h后第一次换液，去除悬浮的细胞。以后每3d换一次液，当细胞达80％-90％融合后，进行常规传代培养。

(2)组织块贴壁法

将脐带剪成约2cm长的小段，用含1％双抗的PBS缓冲液重复洗涤2-3次，除去脐带血。纵向剪开脐带，剔除血管。将剩余脐带组织剪成更小的组织小块(常见1mm³)，按一定间距均匀平铺在培养器皿中，后续操作分“翻转干涸”法和“薄层培养”法两种：

A.“翻转干涸”法：将培养皿轻轻翻转过来，置37℃二氧化碳培养箱培养4-6小时，待组织小块微干涸，再缓缓把培养皿翻转过来，慢慢加入少量完全培养基，保证培养液能够没过组织小块，重新放回培养箱中静置培养；

B.“薄层培养”法：将铺有组织块的培养皿正放，静置30分钟，使组织块更好的贴壁，缓慢加入少量培养液覆盖住组织块表面，37℃二氧化碳培养箱静置培养。

通过A或B步骤完成铺块后，第1～7天绝对静置，之后每3天全量换液，观察组织块周边贴壁细胞爬出情况，操作时轻拿轻放。