[发明专利]鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1（ITS1）通用引物设计方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1（ITS1）通用引物设计方法及应用。

背景技术

鳎科(Soleidae)体呈椭圆形，极为侧扁，两眼都位于身体的右侧，有些则位于左侧方，口小且不对称，上下颌不发达，有些鱼种的吻端下垂，盲侧的牙齿较为发达，有细齿带，腭骨则没有牙齿，前鳃盖骨缘外覆盖有皮膜或鳞片。鱼体外被有圆鳞、栉鳞或皮膜，侧线单一，背鳍起始于眼睛的上方，背鳍、臀鳍及尾鳍有些会相连，有些则分离。胸鳍小，或无胸鳍，腹鳍也很小，有些鱼的盲侧并无腹鳍，有时会与臀鳍相连。鳎科作为鲽形目鱼类最丰富的类群(约35属175种)，很多种类都具有非常重要的经济价值，但是迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于其核糖体内转录间隔区1的研究更是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1（ITS1）通用引物设计方法，该方法基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计引物序列，所得的引物应用范围广，对核糖体内转录间隔区1的研究具有重要的意义。

本发明的另一目的在于提供所述设计方法设计的通用引物。该引物用于核糖体内转录间隔区1(ITS1)的扩增，速率大，产率高。

本发明的又一目的在于提供所述通用引物在鉴别鳎科鱼类中的应用，该鉴定方法准确高效，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题。

具体而言，本发明一方面提供了鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1（ITS1）通用引物设计方法，具体过程为：

从Genbank获取鳎科鱼类18S rDNA和5.8S rDNA序列，利用ClustalXv1.83做序列的比对，分别在3’端和5’端找出保守序列，作为引物候选区，该方法基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计引物序列，极大地扩大了所得引物的应用范围；

利用OLIGO v6软件对候选区序列进行分析，引物序列选择条件：引物长度23-25bp左右，GC含量40％-65％，退火温度为55-60℃，该条件能够有效避免多聚嘌呤和多聚嘧啶序列的产生，使碱基在引物中能够分布均匀。

在本发明的另一方面，还提供所述设计方法设计的通用引物，其正向引物序列为：TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA，反向引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCGTAG。将引物用于核糖体内转录间隔区1(ITS1)的扩增，速率大，产率高。

在本发明的又一方面，还提供了所述通用引物在鉴别鳎科鱼类中的应用，具体过程为：提取待鉴别鳎科鱼类的基因组DNA，使用通用引物对提取的DNA进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，对扩增产物进行纯化测序。所扩增的ITS1进化速率相对较快，在种间则表现出显著的差异，能够准确高效地鉴别鳎科鱼类，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题。

作为优选，扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物，0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl₂，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。该扩增体系为扩增提供了最优的酸碱度和离子浓度，使聚合酶的活性高，提高了扩增产物的收率。

作为优选，扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响Taq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所公开的引物设计方法是基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计，所得到的引物扩增效率高，扩增的ITS1进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异；将该引物用于鳎科鱼类，准确度高，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题。

附图说明

图1为扩增产物的电泳条带，M为DNA Marker，泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9为扩增产物的电泳结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图作进一步详细描述：

实施例1：