[发明专利]鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1(ITS1)通用引物设计方法及应用在审

专利信息
申请号: 201711348352.6 申请日: 2017-12-15
公开(公告)号: CN107881248A 公开(公告)日: 2018-04-06
发明(设计)人: 龚理;孔晓瑜 申请(专利权)人: 浙江海洋大学
主分类号: C12Q1/6888 分类号: C12Q1/6888;C12N15/11
代理公司: 杭州浙科专利事务所(普通合伙)33213 代理人: 吴秉中
地址: 316000 浙江省舟*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 鲽形目鳎科 鱼类 核糖 体内 转录 间隔 its1 通用 引物 设计 方法 应用
【说明书】:

技术领域

发明属于分子生物技术领域,尤其是涉及鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1(ITS1)通用引物设计方法及应用。

背景技术

鳎科(Soleidae)体呈椭圆形,极为侧扁,两眼都位于身体的右侧,有些则位于左侧方,口小且不对称,上下颌不发达,有些鱼种的吻端下垂,盲侧的牙齿较为发达,有细齿带,腭骨则没有牙齿,前鳃盖骨缘外覆盖有皮膜或鳞片。鱼体外被有圆鳞、栉鳞或皮膜,侧线单一,背鳍起始于眼睛的上方,背鳍、臀鳍及尾鳍有些会相连,有些则分离。胸鳍小,或无胸鳍,腹鳍也很小,有些鱼的盲侧并无腹鳍,有时会与臀鳍相连。鳎科作为鲽形目鱼类最丰富的类群(约35属175种),很多种类都具有非常重要的经济价值,但是迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见,其中关于其核糖体内转录间隔区1的研究更是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1(ITS1)通用引物设计方法,该方法基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计引物序列,所得的引物应用范围广,对核糖体内转录间隔区1的研究具有重要的意义。

本发明的另一目的在于提供所述设计方法设计的通用引物。该引物用于核糖体内转录间隔区1(ITS1)的扩增,速率大,产率高。

本发明的又一目的在于提供所述通用引物在鉴别鳎科鱼类中的应用,该鉴定方法准确高效,克服了形态特征鉴定的缺陷,解决了种质混杂的问题。

具体而言,本发明一方面提供了鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1(ITS1)通用引物设计方法,具体过程为:

从Genbank获取鳎科鱼类18S rDNA和5.8S rDNA序列,利用ClustalXv1.83做序列的比对,分别在3’端和5’端找出保守序列,作为引物候选区,该方法基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计引物序列,极大地扩大了所得引物的应用范围;

利用OLIGO v6软件对候选区序列进行分析,引物序列选择条件:引物长度23-25bp左右,GC含量40%-65%,退火温度为55-60℃,该条件能够有效避免多聚嘌呤和多聚嘧啶序列的产生,使碱基在引物中能够分布均匀。

在本发明的另一方面,还提供所述设计方法设计的通用引物,其正向引物序列为:TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA,反向引物序列为:AAGCGACCCTCAGACAGGCGTAG。将引物用于核糖体内转录间隔区1(ITS1)的扩增,速率大,产率高。

在本发明的又一方面,还提供了所述通用引物在鉴别鳎科鱼类中的应用,具体过程为:提取待鉴别鳎科鱼类的基因组DNA,使用通用引物对提取的DNA进行核糖体内转录间隔区1(ITS1)扩增反应,对扩增产物进行纯化测序。所扩增的ITS1进化速率相对较快,在种间则表现出显著的差异,能够准确高效地鉴别鳎科鱼类,克服了形态特征鉴定的缺陷,解决了种质混杂的问题。

作为优选,扩增反应体系为:取100ng模板DNA,0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物,0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物,2.5μL 10×buffer,0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP,1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2,0.2μL Taq聚合酶混合,加双蒸水至25μL。该扩增体系为扩增提供了最优的酸碱度和离子浓度,使聚合酶的活性高,提高了扩增产物的收率。

作为优选,扩增反应条件为:95℃预变性5min,然后95℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸1min,进行30个循环,最后72℃延伸5min。该条件下,靶序列变性彻底,其不影响Taq酶的活性,引物延伸完全,能够达到有效的扩增量,且非特异性扩增少。

与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明所公开的引物设计方法是基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计,所得到的引物扩增效率高,扩增的ITS1进化速率相对较快,在种内基本趋于相似,而在种间则表现出显著的差异;将该引物用于鳎科鱼类,准确度高,克服了形态特征鉴定的缺陷,解决了种质混杂的问题。

附图说明

图1为扩增产物的电泳条带,M为DNA Marker,泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9为扩增产物的电泳结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图作进一步详细描述:

实施例1:

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