[发明专利]一种利用靶向PD-1抗体沉默免疫细胞负调控受体的方法

说明书

本发明公开了一种利用靶向PD‑1抗体沉默免疫细胞负调控受体的方法，包括以下步骤：(1)分离：取抗凝处理的血液，离心，吸取血浆、白细胞和血小板，去掉红细胞层，得血浆和白细胞的混合物；(2)共浴：将PD‑1单抗，与血浆和白细胞的混合物共浴，得PD‑1抗体处理后的白细胞制品。利用上述方法制备得到的白细胞制品，可用于对于健康人群、肿瘤患者、肿瘤患者免疫治疗后等免疫状态的实验室研究；亦可作为肿瘤患者治疗方案制定的佐证、治疗后的评价；与肿瘤细胞混合，研究不同封闭效果下白细胞对肿瘤细胞的杀伤效果等；也可用于肿瘤患者等需要将自身T淋巴细胞的PD‑1封闭后回输的临床治疗试验中。

技术领域

本发明涉及一种利用靶向PD-1抗体沉默免疫细胞负调控受体的方法，涉及将人血液中淋巴细胞提取及处理技术领域。

背景技术

人体内T细胞的激活需要两个信号，其一是TCR接收APC的MHC呈递抗原信息，其二是来自细胞表面的一系列受体、配体，其中PD-1受体就在其中。而PD-1受体主要表达于T细胞表面和初级B细胞表面，并且在这些细胞的分化和凋亡中发挥非常重要的作用。

研究发现PD-1有两个配体，分别是PD-L1和PD-L2。PD-L1与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，而表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。因此，可利用PD-1抗体沉默效果封闭免疫细胞表面受体PD-1，以此来避免来自肿瘤细胞表面PD-L1与细胞表面受体PD-1结合抑制免疫细胞杀伤肿瘤的效果，从而恢复人体免疫细胞活性，进而增强自身免疫应答。目前，现有技术中通常采用静脉注射的方法注入PD-1抗体，存在以下不足之处：1、PD-1抗体与PD-1的结合效率低；2、无法对封闭效果进行实时监测，不易把控治疗方向。

目前，PD-1单抗只有两种药物，分别在2016年通过FDA(美国食品药瓶监督管理局)认证应用于临床，他们分别是：百时美施贵宝的Nivolumab(商品名Opdivo，也叫纳武单抗)和默沙东的Pembrolizumab(商品名Keytruda，也叫派姆单抗)。

发明内容

针对上述现有技术，本发明将PD-1单抗在体外与人体T淋巴细胞共浴，封闭淋巴细胞表面的PD-1受体，经反复多次实验测试，总结出PD-1单抗与淋巴细胞处理制备技术。本发明的方法能有效提高PD-1抗体结合效率，同时可以通过流式细胞仪检测出封闭的效果。PD-1在体外与富集的T淋巴细胞结合，提高了PD-1抗体与PD-1的结合率，为今后体内外研究、临床研究提供新的技术路线策略。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用靶向PD-1抗体沉默免疫细胞负调控受体的方法，包括以下步骤：

(1)分离：取抗凝处理的血液，离心(2600rpm，离心10min)，得到上层血浆层、中间细胞层(白细胞和血小板)和下层红细胞层，吸取血浆、白细胞和血小板，去掉红细胞层，得血浆和白细胞的混合物；

(2)共浴：将PD-1单抗，与血浆和白细胞的混合物共浴，共浴条件为：5％CO2，37℃，60min；PD-1单抗的用量为：每1ml血浆和白细胞的混合物(含2×106的白细胞)加入2μgPD-1单抗；共浴后，内毒素检测，若呈阳性，过100目筛，得PD-1抗体处理后的白细胞制品。

进一步地，为使分离效果更佳，步骤(1)具体操作方式为：取抗凝处理的血液，加入到50ml离心管中，离心(2600rpm，离心10min)，吸取中间细胞层并将其转移至新的离心管中，再次重复两次离心操作，吸取中间细胞层，与血浆混合，得血浆和白细胞的混合物。为使效果达到最优，应尽量避免红细胞的吸入。为使效果达到最优，所有操作步骤应尽快完成，以防对细胞造成损伤。为使效果达到最优，所有耗材及试剂均需要达到医用级别。