[发明专利]采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法有效
| 申请号： | 201711351111.7 | 申请日： | 2017-12-15 |
| 公开（公告）号： | CN109929027B | 公开（公告）日： | 2020-10-09 |
| 发明（设计）人： | 赵燕燕;陶文杰;刘丽丽;王鑫;王广珺 | 申请（专利权）人： | 山东博安生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/71 | 分类号： | C07K14/71;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36 |
| 代理公司： | 北京北翔知识产权代理有限公司 11285 | 代理人： | 孙占华;冯冲 |
| 地址： | 264670 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 采用 线性 洗脱 步骤 重组 融合 蛋白 纯化 方法 | ||
1.一种VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法，由以下步骤组成：
(1)Protein A亲和层析
用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱MabSuRe LX进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使所述融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用所述含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；
(2)阴离子交换层析
用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱QFF进行平衡，将步骤(1)处理后的洗脱液调节至pH8.30-8.50后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用Tris缓冲液进行冲洗，再用Bis-Tris缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；
(3)阳离子交换层析
用Tris-MES平衡缓冲液对阳离子交换层析柱Capto S Impact进行平衡，将从步骤(2)收集的洗脱液调节至与平衡缓冲液一致后进行上样，使所述融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，此后进行线性洗脱，收集洗脱液；其中，所述线性洗脱以23-100％洗脱缓冲液、4-10个柱体积的方式进行；
所述线性洗脱过程使用上样缓冲液和洗脱缓冲液，所述上样缓冲液pH值是5.80-5.90，并包含浓度为50mM/L的MES，浓度为50mM/L的NaCl；所述洗脱缓冲液pH值是5.80-5.90，并包含浓度为50mM/L的MES，浓度为220mM/L的NaCl；
其中，在所述步骤(1)Protein A亲和层析中，所述含盐的平衡缓冲液是NaH2PO4平衡缓冲液，其中NaH2PO4浓度为20mM/L，NaCl的浓度为110mM/L，该缓冲液的pH值是6.8-7.2；
其中，在所述步骤(1)Protein A亲和层析中，所述不含盐的缓冲液为甘氨酸缓冲液，其中甘氨酸浓度为100mM/L，该缓冲液的pH值是2.8-3.0；
其中，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，所述含盐的平衡缓冲液是Tris平衡缓冲液，其含有50mM/L Tris，50mM/L NaCl，该平衡缓冲液的pH值是8.30-8.50；
其中，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，所述Tris缓冲液的pH值是8.30-8.50，浓度为50mM/L；所述Bis-Tris缓冲液的pH值是5.8-6.1，浓度为50mM/L；
其中，在所述步骤(3)阳离子交换层析中，所述Tris-MES平衡缓冲液中，Tris浓度为50mM/L，MES浓度是50mM/L，NaCl浓度是50Mm/L。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(3)阳离子交换层析中，所述上样缓冲液和所述洗脱缓冲液的pH值都是5.90。
3.如权利要求1所述的纯化方法，其中，所述线性洗脱以23-100％洗脱缓冲液、7-10个柱体积的方式进行。
4.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，所述洗脱液调节至pH8.40进行上样。
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