[发明专利]采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法

说明书

本发明涉及一种VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法，其包括以下步骤：(1)Protein A亲和层析；(2)阴离子交换层析；和(3)阳离子交换层析。本发明的纯化方法很好的避免在阳离子交换层析中洗脱蛋白过程中发生蛋白聚集，从而很大程度减少了纯化方法的步骤。

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，尤其是一种重组血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法。

背景技术

蛋白质通常称为“生物制品”，在今天的医药领域中起重要作用。为了保证生物药剂对人类的安全性，必须特异性地去除可能引起严重危害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质等杂质。另外，药监局对人用蛋白质的质量要求标准很高。人用生物制品其最大的挑战之一是在商品化规模上开发具有成本效益和有效的蛋白质纯化方法。

通常，使用经过基因工程改造能产生感兴趣的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系，通过插入一种含有该蛋白质基因的重组质粒，经过细胞培养来产生蛋白质。获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液后，通常尝试联合应用不同层析技术来将其与细胞产生的其它蛋白质分离。这些技术根据蛋白质的电荷、疏水程度、或大小来分离蛋白质混合物。这些技术中的每一种都可采用数种不同的层析树脂，这使得可对涉及的具体蛋白质制定专用的纯化方案。

血管内皮生长因子(VEGF)是多种肿瘤与血管性眼底疾病的重要治疗靶点，通过与特异性受体——血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合刺激新生血管的形成。

以VEGF为靶点的药物阿柏西普(Aflibercept)，称为VEGF捕获剂融合蛋白是一种重组融合蛋白，现有技术是由人血管内皮细胞生长因子(VEGFR)受体的结合区与人免疫球蛋白G1的可结晶片段(Fc)融合而成。其结构较为复杂，二硫键和糖基化位点较多，其中含有较多的碱性电荷异构体，给下游纯化工作带来很大困难。

中国专利申请(公开号CN104853763A)对该融合蛋白进行了描述，并提供了其单体的氨基酸序列。若要将该蛋白纯化为药用级别，需要四个色谱分析步骤：蛋白质A亲和色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和疏水作用色谱法。而这些繁杂的纯化过程无疑会增加药物的生产成本。该专利申请全文以引用的方式并入本文作为参考。

然而，本申请的发明人发现，此方法在阳离子交换层析步骤之后发生了蛋白凝集现象，并且更换缓冲液和洗脱液无法避免该现象的发生，而需要进行后续处理进一步去除凝集的蛋白，以使纯化之后的产物达到质量标准。

令人惊奇的是，本申请的发明人发现，在将阳离子交换层析步骤中，将洗脱方式由等度洗脱改为线性洗脱后，得到的洗脱液中不发生蛋白聚集的现象，并且收获的体积也小于等度洗脱，大幅减少了纯化工艺所需要进行的步骤的同时，为工艺中下一步的超滤浓缩节约了时间和成本。

发明内容

基于现有技术中存在的以上问题，本发明的目的是提供改良的VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法，尤其是一种包括亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析三个步骤的纯化方法。本发明的纯化方法很好的避免在阳离子交换层析中洗脱蛋白过程中发生蛋白聚集。

本发明所述VEGF捕获剂融合蛋白纯化方法，包括以下步骤：

(1)Protein A亲和层析

用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使所述融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用所述含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(2)阴离子交换层析

用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤(1)处理后的蛋白液调节至pH8.30-8.50后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用Tris缓冲液进行冲洗，再用Bis-Tris缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。