[发明专利]一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂及其应用

权利要求书

1.一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到。

2.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：

（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-80~-70℃超低温冰箱保存待用；

（2）预处理：称取200~220g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织4~6倍体积的20~22mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12000~13000g，旋转离心时间为20~25min，再缓慢滴加1.9~2.1mol/L HCl调节pH至7.8~8.2，再次离心15-20min，设置旋转离心力为12000~13000g，取上清液；

（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在30~35%，搅拌30~35min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置1~2h，再将其放入离心机中离心30~40min，离心过程中控制旋转离心力在12000~13000g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在50~60%，静置2~3h，然后放入离心机中离心40~50min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入3~4mL摩尔浓度为20~22mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在7.8~8.2，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为18~24h，透析完成后将透析液放入离心机中离心20~25min，控制旋转离心力为12000~13000g，弃沉淀取上清液；

（4）层析：将透析后离心得到的上清液进行DEAE-Sepharose阴离子交换层析，测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；

（5）浓缩：使用截留分子量为9.8-10.2kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。

3.根据权利要求2所述的一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述步骤（4）中上清液进行DEAE-Sepharose阴离子交换层析的方法为：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用20~22mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，对吸附的蛋白组分用浓度为0~0.5mol/L NaCl进行线性洗脱，洗脱流速控制在1~1.2mL/min，每管收集5~10mL，得到柱层析液。

4.根据权利要求2所述的一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述步骤（4）中，柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性的测定方法为荧光法。

5.一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂应用于增加曼氏无针乌贼产卵量。