[发明专利]一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂及其应用

说明书

本发明涉及蛋白酶抑制剂技术领域，公开了一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂及其应用。该CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到，经过样品准备、预处理、硫酸铵分级沉淀、层析和浓缩得到较高浓度纯化的CTSD组织蛋白酶抑制剂，将次抑制剂应用于增加乌贼产卵量。本发明CTSD组织蛋白酶抑制剂对延缓曼氏无针乌贼的死亡时间增加其产卵量具有显著效果。

技术领域

本发明涉及蛋白酶抑制剂技术领域，尤其是涉及一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂及其应用。

背景技术

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)属于头足纲、乌贼目、乌贼科、无针乌贼属，一年生，具有很高的营养价值和药用价值，曾经是东海广泛分布的物种。但是，20世纪70年代末以来，产量连续降至最低水平，80年代中后期，浙江沿海渔场曼氏无针乌贼已经无法形成渔汛，并逐步绝迹。修复曼氏无针乌贼资源，逐步恢复我国四大海产工作本世纪初已开展。随着曼氏无针乌贼人工育苗技术的突破，曼氏无针乌贼的人工养殖业已快速发展。头足类动物的视腺(optic gland)是控制生殖系统成熟的视神经内分泌器官。类似于脊椎动物中存在的，由下丘脑神经元产生一种GnRH的神经肽并调节垂体—性腺轴，在章鱼中也有一个视腺—性腺轴的神经控制轴，视腺广泛存于头足类动物中，为一对位于视神经束的后缘的卵圆形器官。视腺在头足类生命周期中的作用类似于控制性发育的垂体的作用。视腺还调节卵巢中的蛋白质合成，刺激性腺的有丝分裂，影响交配行为、摄食和寿命。

人工养殖中，产卵量是检测养殖成果最为重要的指标之一。在曼氏无针乌贼性腺发育成熟后会进行交配、产卵，处在产卵期的曼氏无针乌贼同其他头足类一样，基本不再摄食，且日益消瘦，产卵后的雌性乌贼消瘦而虚弱，快速死亡，死亡的雌体卵巢中尚存留不少大小不等的未成熟卵子，目前有关曼氏无针乌贼快速死亡的原因尚无报道。经过本发明实验研究发现组织蛋白酶CTSD基因与物种免疫、发育和死亡有密切的关系，转录组数据分析发现在产卵中到产卵后死亡前的时期，曼氏无针乌贼视腺组织中的CTSD基因的表达量显著增加，另外利用RT-PCR 分析证明曼氏无针乌贼在产卵中和产卵后死亡前时期中CTSD基因表达量都是明显上调，所以在曼氏无针乌贼产卵后死亡视腺中的CTSD基因的过表达会导致曼氏无针乌贼在产卵中过早死亡，死亡的雌体卵巢中尚存留不少大小不等的未成熟卵子，使曼氏无针乌贼的产卵量较少。

发明内容

本发明是为了克服现有技术曼氏无针乌贼过早死亡导致的产卵量较少的问题，提供一种能够延缓曼氏无针乌贼的死亡时间，增加其产卵量的CTSD组织蛋白酶抑制剂。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到。

在实验研究过程中发现CTSD组织蛋白酶能够促进曼氏无针乌贼的死亡，导致其产卵量下降。

本发明从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到CTSD组织蛋白酶的抑制剂，在曼氏无针乌贼产卵后死亡前抑制视腺中的CTSD基因过表达，延缓曼氏无针乌贼的死亡时间，增加其产卵量。另外，本发明CTSD组织蛋白酶抑制剂是从曼氏无针乌贼内脏组织中提取的，绿色环保，节约生产成本。

作为优选，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：

（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-80~-70℃超低温冰箱保存待用；

（2）预处理：称取200~220g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织4~6倍体积的20~22mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12000~13000g，旋转离心时间为20~25min，再缓慢滴加1.9~2.1mol/L HCl调节pH至7.8~8.2，再次离心15-20min，设置旋转离心力为12000~13000g，取上清液；