[发明专利]一种提高D-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法

说明书

本发明公开了一种提高D‑氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，在甲硫氨酸后面添加三个额外的组氨酸和一个甘氨酸。本发明得到的突变体获得的体积酶活比野生型提高3.4倍。同时突变体经5L发酵罐发酵最终获得体积酶活为86.8U/mL，体积产率为4.52kU·L^‑1·h^‑1，为圆冬红酵母在大肠杆菌中表达获得的最高酶活，加强了该酶的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种提高D-氨基酸氧化酶可溶性异源表达的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(DAAO,EC 1.4.3.3)具有高效立体选择性催化D-氨基酸生成相应的α-酮酸的生物催化剂，该过程同时伴随着还原态的黄素腺嘌呤二核苷酸被分子氧重新氧化生成副产物过氧化氢。D-氨基酸氧化酶前期主要作为关键酶被用于抗生素中间体7-氨基头孢烷酸的合成，由于D-氨基酸氧化酶具有底物的光谱性，D-氨基酸氧化酶也被开发用于食品、药品中D-氨基酸的检测，及应用于手性纯L-氨基酸和α-酮酸的生成。

目前，研究比较透彻且报道具有较好应用潜力的D-氨基酸氧化酶主要来源于圆红冬孢酵母菌和三角酵母。大肠杆菌作为高效异源表达蛋白的首选宿主具有培养简单、遗传信息透彻和分子操作方便等优势，但是D-氨基酸氧化酶在大肠杆菌中异源表达主要存在于包涵体中酶活很低，且活性的D-氨基酸氧化酶对大肠杆菌细胞壁D-丙氨酸又降解作用阻碍了其高效表达。针对异源表达外源基因时出现包涵体现象，目前主要的解决办法有：密码子偏好性优化、低温诱导或者降低诱导剂浓度、目的蛋白N-端添加分子伴侣或者是融合血红蛋白等大标签可溶性蛋白等等。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过对来源于圆红冬孢酵母菌D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列进行改造来提高其大肠杆菌中的可溶性表达，同时保证大肠杆菌的细胞生长，从而获得最大效益和最大产量的D-氨基酸氧化酶。

本发明的第一个目的是提供一种高效异源表达的D-氨基酸氧化酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，在第二位氨基酸组氨酸后面添加两个额外的组氨酸和一个甘氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，在其甲硫氨酸后面添加三个额外的组氨酸和一个甘氨酸密码子而得到的。

本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pXMJ19。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的基础上，在其第二位氨基酸组氨酸后面添加两个额外的组氨酸和一个甘氨酸密码子而得到的，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌BL21宿主菌中即得到重组基因工程菌。