[发明专利]一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将187位氨基酸由缬氨酸突变成苏氨酸得到的。本发明的突变体酶的纯酶比酶活较突变前提高了38％，60℃的半衰期(t_1/2)较突变期提高了2.9倍。本发明表明10位氨基酸残基突变成半胱氨酸与天然酪氨酸酶的30位半胱氨酸残基形成正确的二硫键从而提高了酶的稳定性和催化效率，加强了该酶的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

酪氨酸酶(Tyrosinase,EC 1.14.18.1)是一种含有双铜离子的金属酶。酪氨酸酶是多功能酶，在氧气的参与下可以催化单酚生成二元酚(一元酚酶活性)；催化二元酚生成相应的醌(二元酚酶活性)。而醌在经过一系列酶催化及非酶催化的氧化还原反应后最终生成黑色素。酪氨酸酶广泛的存在于动植物及微生物中。一般认为人类的毛发、眼睛、皮肤上的颜色都是由酪氨酸酶决定的，因而大多数化妆品行业通过研究酪氨酸酶酶抑制剂来开发美白产品。人体内如果酪氨酸酶代谢异常将会导致一系列疾病的发生，例如白癜风和白化病等。同时禽类的羽毛，及昆虫甲壳的颜色也酪氨酸酶相关，它的产物黑色素可以与蛋白交联结合成坚硬的支架，起到保护作用。在植物体内，酪氨酸酶可以催化生成一些对人体有益的物质，例如茶多酚。此外，水果表面受损时的褐变也与酪氨酸酶相关，食品行业研究开发酪氨酸酶抑制剂来保鲜水果。此外，酪氨酸酶在工业上也有重要的应用。首先，酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成左旋多巴等有益的酚类物质，左旋多巴是效果良好的抗颠麻痹药，已经被广泛的应用于临床。此外，酪氨酸酶还可以用于制备生物传感器，用来检测环境中酚类化合物的浓度。由于工业污染，导致大量的酚类化合物被排放到自然环境中(主要是水源)，导致严重的污染，而大部分酚类化合物对人体有毒害作用，而酪氨酸酶由于底物的广谱性，大部分的酚类化合物均可以被酪氨酸酶催化，因此，酪氨酸酶还可以被用来清除污染环境中的酚类化合物。随着CboFDH三维结构的精确解析，使得对其理性设计和精确的分子改造成为可能。

Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株酪氨酸酶生产菌株(保藏编号为：CCTCC M 2012432)，对S.kathirae SC-1所产的酪氨酸酶的稳定性较低，因此需要提高酪氨酸酶的稳定性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其制备方法等。

本发明的第一个目的是提供一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将187位氨基酸由缬氨酸突变成苏氨酸得到的。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第187位的缬氨酸的密码子突变成编码苏氨酸的密码子而得到的。

本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述酪氨酸酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pET28a。