[发明专利]阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法

说明书

本分案申请涉及阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法。本发明通过琼脂糖凝胶电泳技术定性定量的分析阳离子脂质体与基因的解离过程；通过在复合物中加入荧光染料，建立荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱技术检测阳离子脂质体与基因在细胞外及细胞内的解离过程，拟合其解离动力学曲线符合非线性方程。本发明公开的阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的检测方法，适用于研究带正电荷的阳离子脂质体/基因复合物细胞外及细胞内解离动力学过程，拓宽了琼脂糖凝胶电泳技术、荧光光谱技术的应用，并为阳离子脂质体介导基因递送机制研究及进一步应用研究提供理论基础。

本申请为申请号为2017108574794、申请日为2017年9月20日、发明名称为“阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的检测方法。

背景技术

基因治疗是通过载体向靶细胞或组织引入外源正常基因片段(DNA或RNA)，关闭或抑制异常基因的表达，以治疗因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗要得到进一步的发展，必须克服三个方面的难题：一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因的细胞；二、实现基因表达的可调控性；三、获得具有靶向性的高效的基因载体系统。阳离子脂质体是目前研究最深入、应用最广泛的一种基因递送载体，其介导基因体外递送过程主要分为：阳离子脂质体与基因通过静电作用相结合，形成阳离子脂质体/基因复合物；带正电的复合物通过静电作用吸附于带负电的细胞表面，然后通过内吞作用或者与细胞膜融合而进入靶细胞，形成内涵体；在细胞内，内涵体膜破坏并释放基因，基因被进一步递送到细胞核内，经转录和翻译，最终产生目的基因编码的蛋白质，使转染基因得以表达。在这个过程中，阳离子脂质体/基因复合物进入细胞后，不是所有的基因都能表达，基因必须从复合物中释放，才能发挥它们的作用。因此，基因从复合物中的释放则是基因被宿主转录机制识别而发挥作用的前提条件。

对于阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的研究，国内外相关报道甚少。刘瑞珍^[1]等采用[Ru(phen)₂dppz]²⁺作为探针研究阳离子脂质体/基因复合物、壳聚糖/基因复合物的解离动力学，但是只研究了N/P比例为0.5:1～4:1的复合物的解离过程，只跟踪了复合物在0～6s内的解离过程。国内外尚缺少通过动力学技术对阳离子脂质体/基因复合物宏观时间及微观时间下解离过程的研究，严重制约阳离子脂质体的发展。

另一方面，凝胶电泳作为一种高分辨、高灵敏、高速度、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。其不仅可以很直观地观察到基因从阳离子脂质体/基因复合物中释放情况，而且可以定量的分析基因从复合物中释放的量。目前，对于凝胶电泳在解离动力学方面的应用还未有报道。

再一方面，FRET是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于10nm)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。目前，对于荧光光谱法在阳离子脂质体/基因复合物解离动力学方面的研究还未见报道。

发明内容

为了研究阳离子脂质体/基因复合物解离动力学问题，阐明阳离子脂质体介导基因递送机制提供理论依据，本发明提供检测阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的方法，通过琼脂糖凝胶电泳技术直观且定量的分析不同时间阳离子脂质体与基因解离情况。通过构建荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱仪和停流光谱仪分别从宏观尺度及微观尺度进行阳离子脂质体/基因复合物解离动力学分析，计算基因从阳离子脂质体/基因复合物中不同时间内的释放量，拟合其解离动力学方程。

本发明采用如下技术方案，阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法，具体步骤如下：