[发明专利]内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A-h55及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A‑h55及其应用。一种编码所述内切葡聚糖酶的基因cel5A‑h55，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。生物信息学分析表明，该基因编码的内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族。发明人通过设计引物成功将其克隆，并在原核表达系统中成功表达，经诱导超声纯化所得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为5.0，最适温度为50°C，在50°C以下能保持相对稳定的酶活性，在pH5.0‑9.0下具有较强的pH耐受性，能保持较高的酶活性。该重组内切葡聚糖酶具有较大的研究和工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A-h55及其应用。

背景技术

纤维素作为植物细胞壁的主要组成成分，是目前自然界中最丰富的可再生资源，然而其顽固的结构限制了它的利用。纤维素降解成葡萄糖的过程需要内切葡聚糖酶(Endoglucanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，E.C.3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，E.C.3.2.1.21)三种纤维素酶的系统同作用。其中，内切葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它主要作用于纤维素的非结晶区，随机水解纤维素链中的β-1,4糖苷键，切断纤维素长链，转化为大量不同聚合度的短链，降低纤维素的聚合度，在降解过程中发挥关键的作用。因此，它的生产利用对于纤维素的降解效率至关重要。目前，该酶已经广泛应用于造纸、纺织、食品、生物燃料、动物饲养等行业中。这些产业上的应用需要生产成本低，具有不同的最适pH和温度，以及较好稳定性的内切葡聚糖酶。过去几十年，大量的研究集中在如何减少真菌生产纤维素酶的成本，主要包括菌的随机诱变、工业优化、外源蛋白添加等方法。然而，由于缺乏对复杂酶系和产酶菌的充分了解，这一进程相当缓慢。因此，寻找大量新型的内切葡聚糖酶尤为重要。

随着组学的出现，一些产木质纤维素酶的微生物基因组测序陆续完成，为进一步的研究提供了清晰的遗传背景，越来越多的纤维素酶基因核苷酸序列得以确定，并在大肠杆菌和酵母中得到了表达，有效地补充了传统的酶系统。而转录组测序能够提供基因cDNA序列和基因的表达水平，能够真实反映蛋白在体内的表达情况，因此，从环境微生物转录组信息中发掘内切葡聚糖酶基因是比较新颖，同时也是行之有效的研究方向。

发明内容

本发明提供一种新型的内切葡聚糖酶基因cel5-h55，其原核表达后重组酶Cel5-H55为嗜低温酶；最适反应pH为5.0，最适反应温度为50℃；在pH5.0-9.0下耐受性较强，能保持80％以上酶活性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种内切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种编码所述内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶基因cel5A-h55，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。本发明内切葡聚糖酶基因cel5A-h55来自湖羊瘤胃微生物转录组数据。

一种包含所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h55的重组载体。

一种包含所述木聚糖酶基因cel5A-h55的重组菌。

一种制备内切葡聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到内切葡聚糖酶。

扩增所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h55采用的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物为：H55-F：5’ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAAGAAATTTCTATCGATAGCAATGC 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；H55-R：5’CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTACTTATTCCCCCAACGAATG 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。