[发明专利]一种利用低温等离子体辅助基因编辑的方法

说明书

本发明公开了一种利用低温等离子体辅助基因编辑的方法，包括如下步骤：使用低温等离子体射流处理待转运细胞；在细胞培养液中加入CRISPR/Cas9体系，与处理后的待转运细胞共培养。本发明的方法，操作简便，对细胞的损伤较小，可以很好将常规方法难以转运的CRISPR/Cas9体系转入细胞内，大大提高CRISPR/Cas9体系的基因编辑效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用低温等离子体辅助基因编辑的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术源自于细菌的获得性免疫，用于抵御外源遗传物质入侵，作为一种基因定点编辑技术，其主要通过内切酶Cas9和特异识别靶DNA的引导RNA(single guideRNA,sgRNA)结合起来发挥功能，CRISPR/Cas9对靶DNA的编辑过程如下：1)Cas9-sgRNA复合体特异识别与sgRNA互补的具有PAM序列(Protospacer Adjacent Motif)的靶DNA，2)Cas9对靶DNA进行切割，产生双链断裂(double-stranded DNA break，DSB)，3)细胞通过自身DNA修复机制对切口进行修复而达到基因编辑的效果。

利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑的效率，通常取决于转运CRISPR/Cas9体系进入细胞的方式，待转运的CRISPR/Cas9体系主要包括编码Cas9/sgRNA的质粒、mRNA、Cas9蛋白及预组装的Cas9-sgRNA核酸蛋白复合体等。预组装的Cas9-sgRNA核酸蛋白复合体分子量近200KD(水合粒径接近14nm)，常规方式难以进行转运。

对于CRISPR/Cas9体系的细胞转运，病毒载体表现出较高的转运效率，但是病毒转运前期准备复杂，且存在生物安全因素，因而通常采用以下几种非病毒转运方式：

电穿孔介导CRISPR/Cas9体系进入细胞：通过脉冲电流作用细胞膜产生空洞而转运CRISPR/Cas9体系进入细胞内部，方法简单，普适性高，但是仪器要求高，同时存在较高的细胞致死率，需要大量的细胞以及CRISPR/Cas9体系才可以短暂或者稳定地进行转运。

阳离子脂质体介导CRISPR/Cas9体系进入细胞：脂质体包裹CRISPR/Cas9体系，通过细胞融合的方式将复合体转运到细胞内，表现出较高的转染效率，但是阳离子脂质体对细胞有较高的毒性，同时价格昂贵。

显微注射介导CRISPR/Cas9体系进入细胞：可以通过微细玻璃管直接将CRISPR/Cas9体系注射进入细胞，但是需要精密的仪器设备，同时转染细胞数量有限。

大气压低温等离子体具有温度低、生物化学性质活泼特点，可被广泛应用在生物医学领域，如杀菌消毒、灭活肿瘤细胞、凝血等。利用等离子体中的活性粒子、带电离子、激发态原子等相互作用，使得细菌或细胞体结构发生变化，从而引起其活性的改变或凋亡。如张冠军,常正实,石兴民,等.大气压低温等离子体与生物细胞的相互作用[C]//全国等离子体医学研讨会会议.2013.报导了将大气压低温等离子体用于细菌灭活、用于杀灭部分异常细胞等。

开发出一种低温等离子体辅助高效转运CRISPR/Cas9体系进行基因编辑的方法，在基因编辑应用领域具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用低温等离子体辅助高效转运CRISPR/Cas9体系进行基因编辑的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种利用低温等离子体辅助基因编辑的方法，包括如下步骤：

1)使用低温等离子体射流处理待转运细胞；

2)在细胞培养液中加入CRISPR/Cas9体系，与处理后的待转运细胞共培养。