[发明专利]一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.MGB探针和内参反应引物、MGB探针：

(1)突变检测反应(KRAS-mutation)引物、MGB探针如下：

G12C-F：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAT；

G12S-F AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCGA；

G12R-F AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAC；

G12V-F ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCT；

G12D-F AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGA；

G12A-F AACTTGTGGTAGTTGGAGCTTC；

G13D-F GTGGTAGTTGGAGCTGGAGA；

KRAS-R CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG；

MGB-KRAS FAM-CTGTATCGTCAAGGCACT-MGB；

(2)内参反应(KRAS-ref)引物、MGB探针如下：

KRAS-F GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA；

KRAS-R CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG；

MGB-KRAS FAM-CTGTATCGTCAAGGCACT-MGB。

其中，F：正向引物，R：反向引物。

试剂盒中的其他试剂及溶液为PCR和DNA测序的常规试剂。

2.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测人KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括：

1)提取样本DNA,使用天根生化科技(北京)有限公司:石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，货号为DP331；

2)PCR扩增：

按下表配置荧光定量PCR反应体系(20μL):

每条引物的终浓度均为200nM，Taqman探针的终浓度为50nM。

PCR反应程序：37℃，2min；95℃预变性10min；50cycles:95℃,10sec、60℃40sec(收集荧光)。

荧光定量PCR时，将Ref反应设置成内参，在荧光定量结束后，可直接读取样本的△Ct值。

每个批次检测反应均设置阳性对照(PC)、阴性对照(NC)和空白对照(NTC)。其中，2×qPCR mix包含：Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂以及反应缓冲液。

3)结果分析：PC、NC和NTC均正常，结果有效。

△Ct＝Ct(KRAS-mutation)-Ct(KRAS-ref)。当△Ct≤10.0时，判定检测结果为阳性，即存在KRAS基因突变；当△Ct＞10.0时，判定检测结果为阴性，即KRAS基因为野生型。