[发明专利]脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法

权利要求书

1.一种脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤

步骤一，RNA提取，提取方法如下

a,取EP管，加入二巯基乙醇，再加入裂解液；

b,加入样本后剧烈振荡，简短离心；

c,加入75％乙醇，颠倒混匀，简短离心，收集混合液；

d，将部分混合液加入到离心柱中，离心，弃去滤液；

e，将余下的混合液加入离心柱中，离心，弃去滤液，不更换离心柱上的收集管；

f，在离心柱中加入洗涤液一，洗涤液一内包括胍盐、乙醇，离心，弃去离心液及收集管；

g,取新的收集管套在离心柱下面，在离心柱中加入洗涤液二，洗涤液二内包括乙醇，离心，弃去离心液，不更换收集管；

h,在离心柱中再加入洗涤液二，离心，弃去离心液及收集管；

i，准备新的收集管，置于离心柱下面，离心，弃去离心液及收集管；

j，取新的EP管置于离心柱下面，加入无RNase的去离子水于离心柱中，放置后，离心；弃离心柱，EP管内为样本中提取的样本RNA；

步骤二，测量反应体系的配置，每25μL测量反应体系配置方法如下，

a，取以下反应液，12.5μL的PCR buffer，0.5μL的Ex Tap HS,0.5μL的RT Enzyme Mix,0.6μL的20pmol/μL上游引物,0.6μL的20pmol/μL下游引物，0.3μL的20pmol/μL探针，5.0μL的无RNase的去离子水；

b，将上述反应液混匀后离心，按照每管20μL分装于PCR管中；

c，加样，将步骤一中提取好的样本RNA，加入分装好的PCR反应管中，模板量5μL；

步骤三，RT-PCR反应，循环条件如下，程序1，循环数1，温度42℃，反应时间30min；程序2，循环数1，温度95℃，反应时间2min；程序3，循环数40，在95℃下反应5sec，在55℃反应35sec,在55℃时收集荧光信号；对照试验设置如下，阴性对照：以无RNase的去离子水代替样本，完成步骤一和步骤二；阳性对照：以乙脑病毒代替样本，完成步骤一和步骤二；

步骤四，结果判断，阈值设定为以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准；当CT值＜34.0的样本为阳性，CT值≥34.0的样本及无数据的样本为阴性。

2.根据权利要求1所述的脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法，其特征在于：

步骤一，RNA提取，每200μL的样本，提取方法如下

a,取EP管，加入二巯基乙醇6μL，再加入裂解液600μL；

b,加入200μL样本后剧烈振荡，简短离心；

c,加入600μL 75％乙醇，颠倒混匀，简短离心，收集混合液；

d，将700μL混合液加入到离心柱中，离心，弃去滤液；

e，将700μL的混合液加入离心柱中，离心，弃去滤液，不更换离心柱上的收集管；

f，在离心柱中加入700μL洗涤液一，离心，弃去离心液及收集管；

g,取新的收集管套在离心柱下面，在离心柱中加入500μL洗涤液二，离心，弃去离心液，不更换收集管；

h,在离心柱中再加入500μL洗涤液二，离心，弃去离心液及收集管；

i，准备新的收集管，置于离心柱下面，离心，弃去离心液及收集管；

j，取新的EP管置于离心柱下面，加入30μL无RNase的去离子水于离心柱中，放置后，离心；弃离心柱，EP管内为样本中提取的样本RNA。