[发明专利]脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法

说明书

本发明公开了一种脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法，包括步骤一，提取RNA；步骤二，配制测量反应体系；步骤三，RT‑PCR；步骤四，结果判定。本发明具有以下优点和效果：提取脾氨肽口服冻干粉中间体内的RNA，裂解细胞后通过洗涤液多次洗涤离心柱，将吸附在离心柱上的生物分子如蛋白质、糖等物质去除，通过离心使RNA分子从离心柱上脱离，得到样本RNA，再配制测量反应体系，经过RT‑PCR反应后，得到检测结果，操作方便，检测结果可靠，适用于脾氨肽口服冻干粉中间体内检测乙脑病毒。

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法。

背景技术

脾氨肽口服冻干粉是从健康新鲜动物脾脏如猪脾脏中提取的复合物，包括氨基酸、肽及核苷酸。临床观察显示，脾氨肽能有效提高患者的抵抗力，减少呼吸道感染的发生率，并具有调节细胞免疫的功能。乙脑病毒即流行性乙型脑膜炎病毒，呈球状，核酸为单链RNA，幼猪是乙脑病毒的主要传染源和中间宿主，乙脑病毒进入人体后，在血管内皮细胞、淋巴结、肝、脾等吞噬细胞内增殖，并经血液循环达到脑部而引起炎症。

国家药品标准WS1-(X-002)-200Z中，对脾氨肽口服冻干粉的质量控制中没有乙脑病毒的检测项目，脾氨肽口服冻干粉的生产过程中，含有乙脑病毒的猪胰脏混入到原料中后，会直接影响药品的品质和安全。为进一步保证药品的品质与安全，因此，有必要建立一种适用于脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法，具有检测脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸的效果。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种脾氨肽口服冻干粉中间体乙脑病毒核酸检测方法，包括以下步骤，

步骤一，RNA提取，提取方法如下

a,取EP管，加入二巯基乙醇，再加入裂解液；

b,加入样本后剧烈振荡，简短离心；

c,加入75％乙醇，颠倒混匀，简短离心，收集混合液；

d，将部分混合液加入到离心柱中，离心，弃去滤液；

e，将余下的混合液加入离心柱中，离心，弃去滤液，不更换离心柱上的收集管；

f，在离心柱中加入洗涤液一，洗涤液一内包括胍盐、乙醇，离心，弃去离心液及收集管；

g,取新的收集管套在离心柱下面，在离心柱中加入洗涤液二，洗涤液二内包括乙醇，离心，弃去离心液，不更换收集管；

h,在离心柱中再加入洗涤液二，离心，弃去离心液及收集管；

i，准备新的收集管，置于离心柱下面，离心，弃去离心液及收集管；

j，取新的EP管置于离心柱下面，加入无RNase的去离子水于离心柱中，放置后，离心；弃离心柱，EP管内为样本中提取的样本RNA；

步骤二，测量反应体系的配置，每25μL测量反应体系配置方法如下，

a，取以下反应液，12.5μL的PCR buffer，0.5μL的Ex Tap HS,0.5μL的RT EnzymeMix,0.6μL的20pmol/μL上游引物,0.6μL的20pmol/μL下游引物，0.3μL的20pmol/μL探针，5.0μL的无RNase的去离子水；

b，将上述反应液混匀后离心，按照每管20μL分装于PCR管中；

c，加样，将步骤一中提取好的样本RNA，加入分装好的PCR反应管中，模板量5μL；