[发明专利]一种用于同时检测五种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法

说明书

一种用于同时检测五种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。该试剂盒含有58条探针，所述的探针为SEQ ID NO.1～58所示的核苷酸序列。本发明的有益效果：本发明通过特异性引物、探针设计，采用基因芯片方法，可实现多达5种实验动物重要病原体、58种特异性探针的一次性高通量快速检测，为后续病原控制和政府决策提供依据。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于同时检测五种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法。

背景技术

医学实验动物是生物医学研究不可缺少的组成部分。实验动物源性的烈性传染病、人畜共患病病原体不仅影响动物的正常生存和科学实验的结果，还对科研人员的健康乃至生命带来重大威胁，随着转基因动物的推广使用，我省近几年已多次发生实验动物来源的重要病原体感染事件，对社会生物安全的威胁日趋增大。2008年，浙江省杭州市某实验动物繁育机构突发疑似大鼠种群污染汉坦病毒事件，由于缺乏多病原的快速鉴别诊断技术等原因，导致病原确诊过程长达数周，该事件在浙江省科研、卫生系统内一度引起恐慌，最终导致大批大鼠被扑杀。2009年某实验豚鼠和实验兔养殖基地发生沙门氏菌感染，因病原鉴别诊断滞后导致大批动物死亡。2011年杭州市某高校实验动物中心暴发疑似鼠痘病毒感染事件，由于发病症状复杂(部分症状不符合典型Ect感染特征)、检测手段单一、缺乏系统完善的鉴别诊断技术等，虽然血清病毒抗体ELISA阳性诊断经多省权威机构验证，但因抗体验证长达数月、缺乏其他病原体排除方法等验证手段，严重延误了病原确诊和应急处置，这些事件无不警示我们建立实验动物重要病原体快检技术的必要性和迫切性。

近年来，普通PCR技术和核酸杂交技术的应用大大的促进了病原微生物检测的发展。鉴于实验动物公共安全的重要性，淋巴脉络丛脑膜炎病毒、泰泽病原体、汉坦病毒、支气管鲍特杆菌和鼠棒状杆菌五种病原体在国内外已有PCR检测方法的报道，项目组也已建立具备独立知识产权的PCR检测技术，如用于弓形虫抗原检测的保守基因主要是B1基因、P30基因和核糖体DNA等，其中又以高度特异的35拷贝Bl基因应用最为广泛。汉坦病毒为单股负链RNA病毒，基因组S段与L段相对保守，但在不同毒株间也有较高多样性，因此采用常规的RT-PCR法检测较困难，需根据不同毒株序列单独设计引物和探针进行独立检测和分型，朱进等根据该特点研究建立了针对汉坦病毒的微阵列芯片检测技术。袁文等针对小鼠肝炎病毒核衣壳蛋白基因序列设计了6条特异性引物，建立的逆转录环介导等温扩增检测技术可检测0.1pg/μL RNA。有文献根据仙台病毒F蛋白基因建立RT-PCR的检测方法。泰泽病原体是一种专营细胞内寄生的革兰阴性杆菌，其分子生物学检测主要针对196bp DNA和16S rRNA等。

上述方法有效填补了病原体在国家标准中缺乏分子诊断技术的空白，但是：①近年发生的多起感染事件，其病理变化和流行特点往往疑似多种病原或呈混合感染，均需进行鉴别诊断和多病原排除；②现有PCR技术均以检测一种或少数几种细菌或病毒为主，且多针对某一保守基因设计单独引物、探针等。应用现有PCR方法多次甚至反复针对不同病原的检测可能都无法精确定位到病原体，现有检验方式难以满足快速、高通量的多病原筛查要求，微阵列芯片恰恰具有高通量、集成化、微型化、自动化并且快速、特异性强等特点，该方法已应用于细菌耐药性监测与药物筛选、基因多态性和基因突变分析、转基因食品检测等领域。目前国内外仅实验动物全球最大供应商—Charles River建立了病原体PRIA微阵列芯片检测法，此芯片一次检测二十多种病原，已广泛用于该公司内部的实验动物健康检查和质量控制，但该方法根据北美特点检测了支原体、沙门氏菌、支气管鲍特杆菌、鼠棒状杆菌等人畜共患病病原，其他二十多种均是国内SPF等级以上需排除病原，我国国家标准中清洁级动物(该等级啮齿动物在国内使用范围最广)明确需要排除的淋巴脉络丛脑膜炎病毒、泰泽病原体、汉坦病毒、支气管鲍特杆菌、鼠棒状杆菌均未列入芯片检测中，因此该芯片并不适用于我国目前的现状。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于同时检测五种实验动物病原体的基因芯片试剂盒及其检测方法的技术方案。