[发明专利]一种高效快速的菊花转基因方法

权利要求书

1.一种高效快速的菊花转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取菊花茎段作为外植体置于预培养基上进行预培养；

（2）将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行活化和培养，然后富集菌体，并用MS液体培养基重悬作为侵染液；

（3）将步骤（1）中预培养后的外植体浸入侵染液中采用真空负压法对其进行侵染；

（4）将侵染后的外植体置于预培养基上在黑暗条件下进行共培养；之后在脱羧培养基上进行脱羧培养，最后依次使用选择培养基1和选择培养基2进行选择培养，确定无农杆菌爆发后，继代至生根培养基进行进一步的生根筛选得到菊花转基因植株；

步骤（1）中所述的茎段包含未分化的腋芽；

步骤（2）中将所述的农杆菌菌液摇菌培养至OD600为0.6；

步骤（3）中所述真空负压法对外植体进行侵染的方法具体包括如下步骤：

a. 将预培养后的外植体放入注射器中；

b. 吸取侵染液于所述的注射器中，使外植体完全浸入侵染液中，排出注射器中的气体并将注射器前端口密封；

c. 拉动注射器活塞，并摇动注射器，使侵染液侵入茎段内，使注射器保持负压状态，并不时摇动注射器，直至非负压状态下所有茎段沉入侵染液底部；

步骤（1）和（4）中各培养基的配方为：

预培养基： MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1mg/L；

脱羧培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+Carb 350mg/L；

选择培养基1：MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.1mg/L+Carb 160mg/L+抗生素10mg/L；

选择培养基2：MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.1mg/L+Carb 80mg/L+抗生素 8mg/L；

生根培养基：MS+抗生素 9 mg/L；

所述的抗生素为与所述重组表达载体所具有的抗性相关的抗生素；

步骤（1）中所述预培养的时间为3天；

步骤（4）中在黑暗条件下进行共培养的时间为2~3天；所述脱羧培养的时间为7天；选择培养时每15天继代一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述真空负压法对外植体进行侵染的方法为：将预培养后的外植体和侵染液置于密闭容器内并使外植体完全浸入侵染液中，震荡容器且使容器保持负压状态直至非负压状态下所有外植体沉入侵染液底部。

3.权利要求1或2所述的方法在快速进行转基因菊花培育中的应用。