[发明专利]一种高效快速的菊花转基因方法

说明书

本发明公开了一种高效快速的菊花转基因方法，属于菊花遗传育种及分子生物学领域。该方法包括：(1)取菊花茎段作为外植体置于预培养基上进行预培养；(2)将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行活化和培养，然后富集菌体，并用MS液体培养基重悬作为侵染液；(3)将步骤(1)中预培养后的外植体浸入侵染液中采用真空负压法对其进行侵染；(4)将侵染后的外植体置于预培养基上在黑暗条件下进行共培养；之后在脱羧培养基上进行脱羧培养，最后依次使用选择培养基1和选择培养基2进行选择培养，确定无农杆菌爆发后，继代至生根培养基进行进一步的生根筛选得到菊花转基因植株。与传统叶盘法菊花转基因相比，本发明显著缩短了转基因的时间，提高了菊花转基因的转化效率，减少了科研工作者的工作量，为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径，也为其他植物的转基因提供了新思路。

技术领域

本发明涉及菊花转基因领域，不同于传统叶盘转基因法，本发明是通过真空负压法处理菊花茎段，解决了传统叶盘法中存在的转化效率低和耗时长的两大难题，实现高效、简便并能稳定遗传的菊花转基因体系的构建。

背景技术

菊花原产中国，是我国十大名花和世界四大切花之一，产量居首，在花卉生产中占有十分重要的地位，而现有的菊花品种无法完全满足大众日益增长的需求，因此急需加快菊花育种和遗传研究工作的进度。

根癌农杆菌介导的转基因技术是获得遗传修饰有机体的常用方法之一，同时也是研究基因功能的重要手段。在长期的基因工程实践中，人们已经注意到不同的植物由于受基因型、发育状态、组培难易程度等因素影响，相应地应该采取不同的基因转化方法，常用的有原生质体与农杆菌共培养法、叶盘法等。原生质体与农杆菌共培养法转化效率高，无嵌合体；但操作复杂，必须有良好的原生质体培养及植株再生技术，因而在许多重要作物中的应用受到限制。叶盘法的出现推动了农杆菌介导转化方法的应用，成为现在广为应用的方法之一。在1991年，科研工作者们通过叶盘转化的方法获得菊花转基因阳性株系，自此叶盘法在菊花转基因工作中得到广泛应用。然而，转化效率低、转化时间历时较长等问题限制了菊花转基因工作的进行，同时不同菊花品种无通用的成熟遗传转化体系，大大影响了相关课题的开展和科研进度。

因此，设计一种新的高效快速的菊花转基因方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效快速的菊花转基因方法，解决传统叶盘法转基因过程中转化效率低和耗时长的问题，为菊花的高效转化和基因功能分析提供新途径。

本发明的目的通过以下技术方案实现的：

一种高效快速的菊花转基因方法，包括以下步骤：

(1)取菊花茎段作为外植体置于预培养基上进行预培养；采用茎段作为外植体是本发明技术方案的主要发明点之一，本发明的研究表明，在使用茎段、叶盘、叶柄为外植体进行转基因分化过程中，以茎段为外植体的出芽率和转化效果明显高于另外两种外植体。这是由于茎段相对于叶盘和叶柄来说，具有更强的分化能力。选择未有腋芽分化的茎段为外植体，相对来说可降低嵌合体的发生率。

(2)将转化有重组表达载体的农杆菌菌液进行活化和培养，然后富集菌体，并用MS液体培养基重悬作为侵染液；所述的重组表达载体为插入有目的基因的植物表达载体，所述的植物表达载体具有特定的抗生素抗性。

(3)将步骤(1)中预培养后的外植体浸入侵染液中采用真空负压法对其进行侵染；

(4)将侵染后的外植体置于预培养基上在黑暗条件下进行共培养；之后在脱羧培养基上进行脱羧培养，最后依次使用选择培养基1和选择培养基2进行选择培养，确定无农杆菌爆发后，继代至生根培养基进行进一步的生根筛选得到菊花转基因植株。

步骤(1)中所述的茎段包含未分化的腋芽。步骤(2)中将所述的农杆菌菌液摇菌培养至OD600为0.5～0.7，优选为摇菌培养至OD600为0.6左右再进行菌体富集。OD过低，菌量少；OD过高，菌量过多或者活性变差，会影响侵染效果或者导致后续培养过程中农杆菌爆发。