[发明专利]单向式羊膜脱细胞方法

说明书

本发明涉及一种单向式羊膜脱细胞方法，包括以下步骤：a)新鲜羊膜的剥离和清洗；b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜。与现有技术相比，本发明结合了羊膜结构特点，采用单向式脱细胞方法，将羊膜基质层保护起来，使羊膜平铺展开，上皮面充分接触脱细胞溶液，有利于彻底脱出羊膜上皮细胞，而基质层极少量的细胞则由于组织的渗透性只接触少量脱细胞溶液而被脱除。该脱细胞方法操作简单、方便，保证了工艺的稳定性，有利于大规模生产。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，尤其是涉及一种单向式羊膜脱细胞方法。

背景技术

羊膜，即人胎盘粘膜，为胎膜的最内层，与绒毛膜相贴紧密，正常羊膜厚为0.02-0.5mm，光滑，半透明薄膜，具有一定的韧性，无血管、神经和淋巴管，由单层上皮细胞层、致密的基底膜以及无血管的基质等成份组成。羊膜基质中含有大量的胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白等成份，由于其含有生长因子、极低的免疫原性、抗菌、减轻炎症、抗纤维化、抑制新生血管形成等特性，在医疗领域有100多年的应用历史，其主要用途有眼表疾病修复、鼓膜损伤修补、烧伤后表面覆盖等。

目前临床上使用的羊膜主要为新鲜羊膜、深冷保存羊膜和脱细胞羊膜(也称羊膜脱细胞基质)。国外多采用深低温(-80℃)保存的含有上皮细胞的羊膜，国内已有在临床应用的干燥常温保存的含上皮细胞的羊膜，但技术工艺要求复杂，且由于羊膜上皮细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。羊膜脱细胞基质不含羊膜上皮细胞，保留了羊膜基底膜与基质层，它的主要成分是Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型胶原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白，是一种天然的细胞外基质，是良好的组织工程生物载体材料。但作为同种异体生物组织支架材料，应用于临床的主要问题在于要克服其内在细胞所带来的免疫原性。

常用的羊膜脱细胞处理方法是采用表面活性剂或表面活性剂结合机械力刮除，胰酶酶解及物理方法。

公开号为CN103114073B的中国专利公开了一种人羊膜的脱细胞方法，其采用表面活性剂TritonX-100结合胰脂酶和DNA酶，用浸泡震荡方式脱除羊膜中的细胞，但由于羊膜较薄，在溶液中极易卷曲(或扭曲)形成空泡，漂浮在溶液上表面而无法有效接触处理溶液，不能达到完全脱细胞效果，且对羊膜基质的力学和化学等性能有不同程度的损伤。

公开号为CN1594555A的中国专利公开了羊膜3D基质组织工程支架羊膜平铺固定完全脱细胞方法及装置，其采用先用胰蛋白酶浸泡对羊膜脱细胞处理，再将浸泡后的羊膜平铺在固定装置上，通过旋转体使胰蛋白酶溶液旋动进而再次脱细胞。胰蛋白酶对细胞外基质有破坏作用且不易去除，制备过程中可能会产生二次污染，并且该发明采用先浸泡酶处理再平铺酶处理，过度酶解会破坏羊膜基质的蛋白结构及韧性。此外，该固定装置复杂，不利于大规模生产。

公开号为CN107233623A的中国专利公开了一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法。首先对羊膜进行漂洗消毒，然后浸泡于DMEM和甘油中-80℃保存6个月；然后将浸泡的羊膜从-80℃到37℃反复冻融2～4次，随后将DMEM和甘油洗去在trypsin-EDTA中过夜孵育；然后用含有血清的DMEM对孵育的羊膜进行终止消化，之后用PBS冲洗，冻干后获得脱细胞羊膜。将反复冻融的物理脱细胞方法和胰酶消化的化学脱细胞方法相结合，并调整各工艺步骤相适应，促使羊膜中的细胞被高效彻底地去除且避免机械性损伤，同时保留了羊膜中较多的细胞因子。但是该专利公开的方法周期太长，步骤繁琐。

羊膜的主要细胞位于羊膜上皮层，而基底膜无细胞，基质层只有极少量细胞，而采用单纯的浸泡震荡处理，虽然去除了羊膜上皮面的细胞，但基质层也同样遭受脱细胞试剂的处理，这对基底膜和基质层的结构和成分产生明显损伤。脱细胞处理不只是简单选取脱细胞方法，更应该结合所用组织的结构特点进行无损基质的处理方式。怎样只去除羊膜上皮细胞和保护羊膜基底膜及基质层结构，现有技术中都没有给出解决方案。