[发明专利]金线莲的组织培养方法

权利要求书

1.一种金线莲的组织培养方法，其特征在于，包括：

1）将金线莲的中部茎段进行灭菌消毒，接着将所述中部茎段切碎作为外植体，然后将所述外植体外植体置于基础培养基中进行初次诱导以得到愈伤组织；

2）将所述愈伤组织置于诱导培养基中进行二次诱导以催生不定芽；

3）将具有不定芽的愈伤组织切块以得到愈伤组织块且所述愈伤组织块至少具有两个不定芽，接着将所述愈伤组织块置于增殖培养基中进行增殖培养以得到增殖芽块；

4）将所述增殖芽块置于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；

5）将所述组织培养苗炼苗；

其中，步骤1）-4）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；所述基础培养基为含有TDZ、2,4-D和IAA的MS培养基；所述诱导培养基为含有2iP、蛋白胨、嗜酸乳杆菌的MS培养基；所述增殖培养基为含有玉米素、水解酪蛋白、活性炭的MS培养基；所述生根培养基含有1/2MS培养基。

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，在所述基础培养基中，所述TDZ的含量为0.5-0.6mg/L，所述2,4-D的含量为0.5-0.6mg/L，所述IAA的含量为0.05-0.12mg/L；

在所述诱导培养基中，所述2iP的含量为0.05-0.12mg/L，所述蛋白胨的含量为1.5-2.5mg/L，所述嗜酸乳杆菌的菌落含量为100-150CFU/L；

在所述所述增殖培养基中，所述玉米素的含量为0.6-0.8mg/L，所述水解酪蛋白的含量为0.6-1mg/L，所述活性炭的含量为0.5-0.6mg/L。

3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述基础培养基、诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有6.5-7.0g/L的琼脂和25-30g/L的蔗糖，且pH值为6.0-7.0。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤1）中，所述灭菌消毒具体为：先将所述中部茎段置于60-70重量%酒精水溶液中浸泡30-60s，接着将其置于3-5重量%次氯酸钠水溶液中浸泡3-4min，最后通过蒸馏水进行清洗3-5次。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤1）中，所述外植体的长度为0.6-0.8cm。

6.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，在步骤1）中，所述初次诱导满足以下条件：先暗培养1-2天，接着转入光暗交替的条件下培养8-10天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2500-2800lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。

7.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤2）中，所述二次诱导于光暗交替的条件下进行直至不定芽的高度超过2cm；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2500-2800lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。

8.根据权利要求7所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤3）中，所述增殖培养于光暗交替的条件下进行直至增殖芽块上增殖出的新不定芽的高度为3cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2500-2800lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。

9.根据权利要求8所述的组织培养方法，其特征在于，在步骤4）中，所述生根培养于光暗交替的条件下进行直至组织培养苗的高度为5cm以上；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2500-2800lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60%。

10.根据权利要求1-3中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，步骤1）-4）中的无菌且透气条件通过以下操作获得：培养环境为带防菌透气膜的组培瓶；

优选地，透气膜至少满足以下条件：孔隙为0.2-0.3um，开孔率80-90﹪；

更优选地，所述炼苗的条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2500-2800lux，温度为21-23℃，相对湿度为75-85%，时间为5-7天。