[发明专利]一种生产几丁寡糖的方法

说明书

本发明涉及微生物技术领域，具体是一种生产几丁寡糖的方法。该方法先将粉状几丁质转化为胶体几丁质，再对菌株进行培养、产酶，而后利用该菌株所分泌的低温几丁质酶对制备的胶体几丁质进行酶解反应，得到以几丁二糖为主要产物的几丁寡糖，其产物杂质较少，易于产业化应用研究。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体是一种生产几丁寡糖的方法。

背景技术

几丁质(chitin)，俗称甲壳素或甲壳质，是海洋环境中含量最丰富，自然界中仅次于纤维素的第二大可再生资源。据估计自然界每年生物合成的几丁质约10¹⁰-10¹¹吨。几丁质为N-乙酰-D-氨基葡萄糖和少量D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，其化学结构与纤维素相似，不同之处在于2号碳原子的基团R。国际医学营养食品学会将几丁质命名为除糖、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、水喝纤维素七大生命要素后的第八大生命要素，受到广泛关注。但由于几丁质晶型致密，难于降解，使其应用受到限制。为了扩大几丁质的应用范围，对其进一步加工制备高附加值的几丁寡糖成为近年来的研究热点。

几丁寡糖是分子量小于10000，聚合度2-20的几丁质低聚糖。几丁寡糖不仅具有良好的水溶性、组织兼容性和生物降解性，而且还表现出调节免疫力、抗菌、诱导植物抗病性和促进植物生长等生物活性，可广泛应用于医药工业、食品工业、环境、农业和养殖业等众多领域。

目前，几丁寡糖的制备普遍采用化学法，即用强酸除去盐类、蛋白，用强碱去除脂类或脱除乙酰基等。该工艺耗能大，反应过程及产物的分子量分布难以控制，几丁寡糖产量低，最重要的问题是生产过程中排放出大量的废酸碱水，造成严重的环境污染。因此，近年来寻找一种绿色、高效降解几丁质制备高产高品质几丁寡糖的方法越来越受重视。生物酶法不仅可以解决环境污染问题，而且还具有反应条件温和、反应过程简单、反应产物容易分离且可人为控制产物的聚合度等优越性。

几丁质酶(chitinase,chi,EC3.2.1.14)是专一降解几丁质为几丁寡糖一组酶的总称，根据其作用的部位分为外切几丁质酶(exo-chitinase)和内切几丁质酶(endo-chitinase)。外切几丁质酶一般又分为几丁二糖酶和β-N-乙酰己糖胺酶(β-N-acetyl-D-glucosaminidase,Hex,EC 3.2.1.52)；内切几丁质酶随机水解几丁质多糖链生成几丁寡糖(chitooligosaccharides,(GlcNAc)_n,n>2)。

几丁质是海洋环境最丰富的生物质资源，据不完全统计10％的海洋微生物依赖几丁质为碳源和氮源。海洋具有高盐(3.5％)、高压(﹥100Mpa)、低温、低光照、寡营养等特点的极端环境。复杂多变的生态环境和遗传机制赋予海洋低温几丁质酶特有的作用机制。海洋低温chi还具有低温下高活力及高催化效率，可大大缩短处理时间并省却昂贵的加热/冷却系统，因而在节能方面有相当大的进步；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质等特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产几丁寡糖的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种生产几丁寡糖的方法，包括以下步骤：

(1)将产低温几丁质酶的菌株(分类命名为假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.DL-6，保藏编号为CGMCC No.8580)接种于种子培养基中摇床培养，得到种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液接入产酶培养基中培养，将培养物离心，取上清液，得到含有低温的几丁质酶的粗酶液；

(3)将胶体几丁质、粗酶液用50mM Tris–HCl缓冲液调节pH值至7.0～10.0，调节几丁质酶终浓度为8～12U/L，酶与胶体几丁质比为3000～6000U/g，15～30℃反应后离心，冷冻干燥，得到几丁寡糖。