[发明专利]高效液相色谱-串联质谱检测血清中氨基酸的方法

说明书

本发明提供一种高效液相色谱‑串联质谱检测血清中氨基酸的方法，属于蛋白质分析技术领域，其先向血清样品加入同位素氨基酸作为内标，再通过液‑液萃取法提取样品混合物中的氨基酸，使用HILIC色谱将氨基酸分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析，具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点。

技术领域

本发明属于蛋白质分析技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱-串联质谱检测血清中氨基酸的方法。

背景技术

氨基酸是指含有氨基的羧酸，基本氨基酸及其类似物是生命的物质基础和必需的营养成分。氨基酸具有广泛的生物学功能，作为蛋白质的基本组成单位和细胞信号分子，在基因表达和蛋白质磷酸化中起到重要调节作用。

目前采用非衍生化LC-MS方法对氨基酸进行定量分析常用的策略是在反相色谱分离的流动相中添加离子对试剂(七氟丁酸、十三氟庚酸、和全氟辛酸等)，以达到氨基酸在反相色谱柱有效保留和分离，这种方法虽然解决了氨基酸在色谱柱上的保留和分离问题，但是离子对试剂严重抑制质谱响应信号，大大影响了ESI源对待测物的离子化效率，导致低丰度氨基酸难以检测。

发明内容

基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种高效液相色谱-串联质谱检测血清中氨基酸的方法，其先向血清样品加入同位素氨基酸作为内标，再通过液-液萃取法提取样品混合物中的氨基酸，使用HILIC色谱将氨基酸分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析，具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点。

本发明通过以下详细技术方案达到目的：

高效液相色谱-串联质谱检测血清中氨基酸的方法，其取10μL血清样本，加入10μL2mM混合内标溶液，涡旋混合，再加入180μL甲醇/乙腈混合液，使用14000rcf、4℃离心15分钟，取160μL上清液进行真空干燥，再使用200μL50％乙腈溶液复溶，使用14000rcf、4℃离心15分钟，取上清液进行HILIC-MS/MS分析；所述的HILIC色谱中的洗脱方式为：

流动相A是25mM甲酸铵+0.08％甲酸水溶液；流动相B是0.1％甲酸的乙腈溶液；

所述的混合内标溶液包括同位素内标氨基酸L-Glutamate-D₅、L-Lysine-D₄、Arginine-¹³C₆、L-Glutamine-D₅、L-Serine-¹³C₃,¹⁵N、L-Methionine-¹³C₅,¹⁵N、L-Phenyalanine(ring-D₅)、L-Tyrosine-¹³C₉、L-Leucine-¹³C₉、L-Histidine-¹³C₆、DL-Proline-D₇、DL-Valine-D₈、L-Threonine-D₅,¹⁵N、L-Aspartate-¹³C₄,¹⁵N、L-Cysteine-¹³C₃,¹⁵N、DL-cystine-D₄、L-Alanine-D₄、L-Tryptophan-¹³C₁₁和L-Ornithine-D₆；