[发明专利]运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法

权利要求书

1.sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非分裂的细胞为神经元细胞，

任选地，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元，

任选地，所述基因改造是通过如下方式实现的：

将无内毒素的sgRNA/CRISPRi表达质粒与pVSVG，psPAX2导入受体细胞，以便获得携带有sgRNA/CRISPRi的慢病毒，所述sgRNA/CRISPRi为靶向基因的sgRNA/CRISPRi；以及利用所述慢病毒感染所述神经元细胞；

任选地，所述受体细胞为HEK 293FT细胞；

任选地，所述导入是PEI介导的。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述基因包括选自Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed的至少之一。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述sgRNA靶向基因转录起始区的上游-50bp～下游300bp；

任选地，所述sgRNA具有SEQ ID NO:1～15所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：

(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；

(2)将退火的所述sgRNA插入到BsmbI消化的所述初始慢病毒质粒，以获得单个sgRNA/CRISPRi的一体化表达质粒。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：

(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；

(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件；

(3)通过PCR扩增所述模板质粒，其中，PCR正向引物3’端包括所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物的5’端具有BsmbI识别序列和待插入第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述人源H1启动子序列的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有待插入第二sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；

优选地，所述PCR正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列；

(4)将(3)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得两个sgRNA/CRISPRi表达质粒，

优选地，所述聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件紧密连接。