[发明专利]运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法

说明书

本发明提出了sgRNA/CRISPRi在非分裂的神经元细胞中进行基因改造中的用途。发明人发现，sgRNA/CRISPRi在神经元中可以阻止靶向基因转录起始，提高单个细胞水平的表型均一性，并呈现卓越的靶向基因的特异性表达沉默。本发明是通过病毒传递CRISPRi策略快速而高效地实现神经元中基因失活，建立原代神经元和动物模型，为神经生物学研究提供灵活而多样的基因操作工具。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体地，本发明涉及sgRNA/CRISPRi在非分裂的神经元细胞中进行基因改造中的用途、快速地构建神经生物学研究的细胞和动物模型的方法。

背景技术

来自细菌和古生菌的CRISPR/Cas9系统已被开发为基因组编辑工具，广泛地用于建立转基因细胞株和动物系。在向导RNA(sgRNA)的指引下，Cas9识别特定的目标基因组区域并引入双链断裂缺口(DSB)，随后细胞主要以随机修复方式完成缺口修补。实现精确的基因操作，目前主要依赖于转基因动物操作平台，基因敲除/敲入的效率以及冗长的制作周期仍然限制遗传操作的动物在实验室里更广泛的应用。基于各类病毒工具发展的基因编辑技术，能够在动物出生后的各个阶段，并且在生理及病理状态下实现在体操作，从分子到细胞，从环路到行为，解析基因型/表型关联，探索脑疾病的致病机制，并在此基础上寻求新的有效的治疗策略。

单个基因可能在生物学过程中发挥着至关重要的作用之外，很多生命过程需要多基因或者信号通路协作完成。迄今为止，在细胞和动物整体水平阐释多基因复杂精神疾病以及蛋白质复合物的动态功能仍旧是生物学研究中的极大挑战，这对于理解疾病进程和蛋白质互作的全新模式具有重大的意义。

大脑中由多种不同类型的神经元组成，它们在生命过程中以及神经疾病进程中发挥着不同的作用。例如多巴胺能，5-羟色胺能，小清蛋白和生长抑素能中间神经元活性的紊乱与精神疾病和神经退行性疾病等密切相关。干扰神经元活动是研究特定神经元亚群以及与之关联的环路/行为变法的重要方法。因而，灵活的特定神经元亚群的基因干扰工具将有助于阐释基因-神经元亚群-环路-行为的模式。

本领域中仍然亟需开发简便易行的基因干扰工具，获得单个或者多重基因敲低的，以及特定神经元亚群的细胞或者动物的基因失活的研究模型。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题或事实的发现而提出的：

一方面，发明人发现，由于神经元随机修复DNA的缘故，在单个神经元水平可能产生多种不一样的基因型/表型变化，例如野生型，嵌合型，完全失活型，甚至功能获得型等。并且，终端分化的神经元具有不可分裂的特性，因而神经元细胞难以像分裂的细胞建立基因型均一的细胞株供研究使用。

另一方面，现有技术中，利用不同品系的小鼠杂交获得多重基因失活的神经元或者动物模型的方法，不仅耗费时间和研究经费，而且缺乏靶向任意多重基因组合的灵活多变性。在出生后小鼠直接注射携带CRISPR/Cas9基因编辑系统的病毒，可以获得多重基因失活的细胞或者动物模型，但是它们靶向的多个基因常常呈现多种的嵌合组合失活，并且它们全部同时失活的神经元比例一般不超过20％，因此这样多个基因嵌合组合失活的模式在单细胞水平极有可能产生混淆的表型。

发明人通过实验意外地发现，sgRNA/CRISPRi能提高单个神经元水平的表型均一性，在神经元中呈现卓越的靶向基因的特异性基因沉默。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。发明人发现，sgRNA/CRISPRi在非分裂细胞中可以阻止靶向基因转录起始，提高单个细胞水平的表型均一性，在非分裂细胞中呈现卓越的靶向基因的特异性表达沉默。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：