[发明专利]一种牛种布氏菌快速检测方法

说明书

本发明提供一种牛种布氏菌的RPA快速鉴别检测方法，其中所使用的引物组的序列为SEQ ID NO:1‑4。本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：30min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10^‑2ng/μl；2)特异性强：采用PRA引物组特异性对牛种布氏菌进行鉴别检测，与其他种、生物型的布氏菌、布氏菌疫苗株及常见非布氏菌株，无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，置于39℃恒温条件下完成反应，不需要使用PCR仪。4)高通量：可在水浴或恒温培养箱中一次性进行大量样品检测，不受PCR仪设备检测孔数量限制。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种牛种布氏菌快速检测方法。

背景技术

布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的一种人兽共患病，该病给畜牧业造成了重大损失，并严重威胁公共卫生安全。牛布病通常是由牛种布氏菌引发的，公牛感染后出现睾丸炎、附睾炎、精囊坏死等多种临床症状，严重影响生产性能；怀孕母牛感染后会引发胎盘炎并导致流产，流产率高达31.2％，牛奶中可带菌。当接触了牛种布氏菌污染的环境、患病动物及产品后，人类可感染发病，表现为发热、盗汗、全身不适，难以治愈，严重者失去劳动能力。因此，实现牛种布氏菌快速鉴别检测，对该病的诊断及有效防控具有重要意义，可降低该病造成的损失和公共卫生风险。

布氏菌分为羊种布氏菌、牛种布氏菌、猪种布氏菌等9个种，不同种布氏菌可根据理化及生物学特性的不同，通过病原分离鉴定的方法鉴别区分，但该方法需要在生物安全三级实验室进行，且耗时长，对人员和设备要求较高。

分子生物学技术的发展，为布氏菌种型的快速鉴别提供了手段，国际上已先后建立基于PCR和荧光定量PCR方法鉴别牛种布氏菌的方法。RPA是近年一种新开发的恒温核酸扩增技术，该方法能在36～40℃恒温条件下于20min内大量扩增目的基因以完成检测，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点。与常规的PCR和荧光定量PCR方法相比，PRA技术反应条件为恒温，不需要进行变性、退火、延伸循环，对实验仪器设备依赖少且反应速度快，特别适用于现场检测。目前该技术已经在一些病原快速检测方面得到应用，但还没有基于RPA技术鉴别牛种布氏菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛种布氏菌的RPA快速鉴别检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一组用于鉴别牛种布氏菌的引物组，所述的引物组的引物信息如下：

Omp2-F:CGTGCGGCATGTAACCGTCGATCGTGTAATC(SEQ ID NO:1)、

Omp2-R:TGCATATATCACGCTTGGTGGTTTCAAGGTT(SEQ ID NO:2)、

Omp31-F:GGTCTCGAAGGCAAAGCTGAAACCAAGGTC(SEQ ID NO:3)、

Omp31-R:GGTATTCCGACTTGAGCGTCCAGTTGTTGT(SEQ ID NO:4)；

本发明还提供一种利用上述RPA引物组检测牛种布氏菌的方法，包括如下步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

2)RPA步骤：将本发明设计RPA引物组及各反应组分，分别加入反应体系中，39℃反应30min。

3)结果检测：回收纯化RPA反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳检测，判定检测结果。

另一方面，本发明的RPA引物组可用于制备检测试剂盒。