[发明专利]一种固定化纤维素酶的制备及其酶水解纤维素的方法

说明书

本发明提供了一种固定化纤维素酶的制备及其酶水解纤维素的方法。制备固定化纤维素酶的方法为交联包埋法，以海藻酸钠为载体，利用海藻酸钠中OH‑和COOH‑的氧原子与Ca2+发生离子交换反应的原理形成凝胶，戊二醛为交联剂，聚乙二醇为致孔剂和亲水剂，加入聚乙二醇可以提高固定化纤维素酶的酶活固定率和酶活力、降低米氏常数、提高载体表面的孔密度，增加酶水解反应的还原糖含量、酶水解得率和TS降解率。在固定化酶水解纤维素的过程中，可以实现纤维素酶的多次循环利用。本发明的制备及应用方法操作简便、固定条件温和、投资低、对环境友好。

技术领域

本发明具体涉及到一种固定化纤维素酶的制备方法，以及固定化纤维素酶用于纤维素水解的方法。

背景技术

纤维素是自然界中分布最广、储量最大的天然高分子，是构成细胞壁的基础物质。每年植物通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，是一种取之不用之不竭的可再生资源。近年来，随着煤、石油、天然气等不可再生资源的逐步枯竭以及环境问题的日益严重，有关纤维素作为可再生资源的利用研究成为当今国际科学研究的前沿领域之一。

纤维素是由β-D-吡喃葡萄糖以(1-4)-β-糖苷键联结而成的长链不分支的均质多糖。分子链具有C1椅式构象。单体上的3个羟基分别位于葡萄糖环单元上的2、3、6碳原子上，其中C-2、C-3、C-6位置上分别是仲醇羟基、仲醇羟基和伯醇羟基。由于自身具有较高的结晶度、分子间和分子内存在很好的氢键，天然纤维素不能熔融，也很难溶于常规溶剂，这极大地限制了纤维素的开发和利用。

纤维素在生物转化过程中，纤维素酶可将其水解为易于利用的可溶性小分子还原糖，以实现木质纤维素的高效利用。纤维素酶作为催化剂，理论上可以多次用于酶水解反应中。纤维素酶是水溶性制剂，在酶水解纤维素的过程中，会与产物融合在一起，一方面造成纤维素酶的流失，另一方面使产物的纯度降低。纤维素酶价格昂贵，其循环多次利用及提高产物纯度是酶水解工艺需解决的主要问题。

纤维素酶的固定化是实现纤维素酶多次循环使用的有效方法。文献：陈伟兵.海藻酸钠/SiO2复合水凝胶的制备及作为固定化纤维素酶载体的研究[D].华侨大学.文中研究表明，以海藻酸钠为主要载体，经NHS和EDC活化海藻酸钠上的羧基后，以KH-550偶联剂，加入纤维素酶将其固定。但是，由于酶分子经过固定后运动受限，从而使得与底物之间的空间位阻增加。固定化酶的米氏常数增高，与游离酶相比，由0.122mg/ml增高至1.10mg/ml，增加了8倍。米氏常数的增高表明酶分子其与底物的亲和力降低，这不利于纤维素酶发挥其有效的水解作用。

发明内容

为进一步解决以上问题，本发明的目的在于，提供一种纤维素酶的固定方法，提高酶分子与底物的亲和力，并将其用于酶水解反应中，实现纤维素酶的循环利用。

本发明采用交联包埋法作为纤维素酶的固定方式。为了提高底物与酶分子之间的亲和力、减少空间阻力，在以海藻酸钠为固定化纤维素酶的载体、戊二醛为交联剂的基础上，加入聚乙二醇；聚乙二醇一方面作为致孔剂，另一方面提高固定化酶的亲水性；交联后的纤维素酶加入到氯化钙溶液中形成凝胶。反应原理为：戊二醛的醛基可以与纤维素酶的氨基发生希夫氏碱交联反应使酶分子相互交联；海藻酸钠G单元OH-和COO-的氧原子与Ca2+发生离子交换反应形成“Egg-box”结构，将酶分子固定；聚乙二醇在海藻酸钠-Ca2+固定体系中部分溶出，在载体表面形成均匀的孔结构，减少传质阻力；同时其含有的羟基和聚乙二醇基与载体和纤维素酶分别形成氢键，增加亲水性。

采用以上方法制备出的固定化纤维素酶，用于纤维素的酶水解反应，水解效果较未添加聚乙二醇相比，得到显著地提高。

具体步骤如下：