[发明专利]一种提取残留DNA的方法

说明书

本发明提供了一种快速、有效的从生物制品中提取残留DNA的方法，包括1)向待提取样品中加入裂解液以释放核酸分子，混合并孵育；2)向样品中加入月桂酰肌氨酸钠盐溶液；3)向样品中加入含有碘化钠、糖原、异丙醇的混合溶液，并在室温环境下孵育；4)将样品离心，除去上清液，收集沉淀。本发明的提取方法步骤简单，结果重复性好且提取的DNA量准确度更高。

技术领域

本发明涉及一种快速、有效的从生物制品中提取残留DNA的方法和提取DNA的新型试剂盒。

背景技术

动物细胞来源的CHO细胞株目前作为药物类蛋白生产的主要宿主细胞之一，其最终产品的杂质含量、安全性都受到严格的控制，比如连续传代宿主细胞系的残留DNA(rDNA)的含量。动物细胞研究表明，当受试体基因组与rDNA发生不正确嵌合反应，有可能会激活肿瘤基因或者使肿瘤抑制基因失活，从而给受试体的健康带来极大威胁。虽然在下游纯化工艺过程中采用一些去除方法，比如protein A亲和色谱、阴/阳离子交换色谱、疏水层析等方法可以显著去除核酸，但是最终的产品中仍残留着痕量的DNA。目前FDA严格规定其rDNA含量不得超过100pg/支，因此高效、准确的全基因组纯化方法和定量方法对药物是否能满足其要求显得非常重要。

对于生物制品中痕量(pg)级的残留DNA含量进行分析，不但要保证有效去除样品本身基质的干扰物质，并在多步提取过程中避免环境中的交叉污染，而且要保证本身提取方法的精准回收率、精密度、重复性等(中国药典2015年版第三部通则9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》技术指南)。USP<1130>介绍，在提取过程中，使用多种处理方式，如蛋白质进行酶解、化学沉淀、洗涤可以显著提高DNA的提取回收率。最初在分子生物学研究中，以苯酚-氯仿为基础的提取方法和以乙醇沉淀为基础沉淀方法，得到了广泛应用，但是其远不能满足生物工程类药物低水平残留DNA的检测。一些商业化的试剂盒(Wako PureChemical Industries,Ltd.公司的DNA Extractor Kit(Code No.295-50201)、Ivy FineChemicals Corporation公司的DNA Extractor EZ-Kit(Code No.B48202)已获得推广，其主要原理是纯化过程中DNA发生沉淀反应，高速离心后得到含DNA的白色球珠，之后仍用含乙醇的洗涤液进行进一步的纯化处理，已除去细胞代谢、脂等物质，再经过干燥、复融后即得纯化DNA液。此种方法需要操作步骤较多，且洗涤步骤容易造成DNA的损失和交叉污染，且洗涤步骤所用到的部分醇类物质仍能造成环境的污染。另外一种广泛使用的提取方法是磁珠法，如Applied Biosystems公司的PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit，提取主要过程为：使用蛋白酶K对样品进行适当的酶解处理，之后在高盐环境下向样品中加入磁珠，在异丙醇存在下、利用“盐桥作用”使DNA与磁珠表面活性基团发生特异的吸附结合，之后利用磁力架将含DNA的磁珠进行转移，之后经过一系列的洗涤移除磁珠表面残留的蛋白降解物质、多糖、细胞代谢物质等，之后用洗脱液从磁珠上面将纯化的DNA洗脱之后进行PCR定量分析(User Guide:Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System)。此种提取方法操作步骤繁琐、所需时间较长、样品通量较低，且洗涤步骤所用到的部分醇类物质也能造成环境的污染。目前针对两种方法的商业化试剂盒虽然已广泛使用，但是除了两种方法自身的技术缺点之外，对于国内公司来说，两种试剂盒都存在着货期较长、采购成本过高的不足。

目前，在样品提取过程中，为了避免回收率过低或者产生额外的污染，对未知样品进行已知浓度的DNA加标处理，然后通过加标浓度回收率的数值来评定提取方法的可靠性，目前广泛接受的标准为：标曲：决定系数(R²)≥0.980，扩增效率：90.0-110.0％，回收率为70.0％-130.0％，RSD％≤30.0％。

发明内容

本发明提供了一种提取核酸的方法，该方法包括：