[发明专利]利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法

权利要求书

1.利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

包括以下操作：

人工合成单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物；

建立融合表达组氨酸标签的重组蛋白基因工程菌株；

在表达融合蛋白的过程中利用镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用使与特异性靶蛋白结合的ssDNA进行筛选；

经过多轮的筛选使与靶蛋白结合的适配子得到富集，对富集的寡核苷酸进行鉴定、测序后，选择高亲和力的核酸适配子成为待选适配子。

2.根据权利要求1所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：合成随机单链 DNA 寡核苷酸文库和相应的引物

包括：

ssDNA：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTTACGAGCCAAAGAGCCGCCAA-3；

正义引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

反义引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

标记5端的生物素标记引物：

生物素标记上游引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

生物素标记下游引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

步骤二：利用大肠杆菌表达靶分子蛋白

（1）利用基因重组的方法构建含His标签的靶基因的原核表达质粒，即重组质粒；

（2）重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），常规IPTG诱导表达，离心收集表达菌体，超声破碎，离心后分别获得含有目的蛋白可溶性表达的超声上清；

（3）利用重组蛋白C端的His标签对诱导表达后的超声上清进行纯化，获得纯化的目的蛋白用于筛选后适配子的鉴定；

步骤三：基于金属离子亲和作用的SELEX筛选

（1）将ssDNA文库溶解于去离子水中，于100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却10-20 min；

（2）将ssDNA文库与表达靶蛋白的大肠杆菌裂解液上清在37℃共孵育2h，使ssDNA文库与消减靶充分作用；

（3）将孵育后的ssDNA文库-MMP14蛋白混合液加入到已经准备好的镍或钴螯合磁珠中，室温孵育20 min，置于磁性分离器上，吸弃上清，并与沉淀中加入90℃预热的洗脱缓冲液（20 mmol /L Tris-Cl，4 mol /L异硫氰酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3），酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收；

步骤四：结合文库的扩增

（1）将乙醇沉淀回收到的ssDNA用水溶解后，使用正义引物和生物素标记下游引物进行PCR反应扩增；

（2）PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性 20秒，52℃退火20秒，72℃延伸20秒，扩增23个循环；最后72℃终延伸5 min；

（3）得到的dsDNA煮沸后立即放置冰上30 min，加入平衡后的Streptavidin-磁珠中混匀，室温放置30 min，使生物素化的dsDNA与磁珠相结合，随后加入0.15 N的NaOH溶液释放ssDNA，异丙醇沉淀后用–20℃保存备用；

步骤五：重复步骤三和四进行n轮筛选，最终完成筛选。

3.根据权利要求2所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

步骤五中所述的n轮筛选为8-15轮筛选。

4.根据权利要求3所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

第一轮筛选中，ssDNA文库的用量为1500 pmol，以后每轮筛选的投入量按照30%递减。