[发明专利]利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法

说明书

本发明涉及利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法。现有SELEX筛选技术存在分离时间长、步骤繁琐的缺陷。本发明人工合成单链DNA文库和相应引物；建立融合表达组氨酸标签的重组蛋白基因工程菌株；在表达融合蛋白时利用镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用使与特异性靶蛋白结合的ssDNA进行筛选；经过多轮的筛选使与靶蛋白结合的适配子得到富集，对富集的寡核苷酸进行鉴定、测序后，选择高亲和力的核酸适配子成为待选适配子。本发明简单高效快速，明显改善了蛋白质需要包被过夜的过程，设备简单，能够从复杂液相标本中筛选针对差异成分的寡核苷酸适配子，也可利用富集的文库对差异成分进行钓取鉴定。

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体富集筛选技术，具体涉及一种利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法。

背景技术

生命科学的研究和对疾病的特异性诊断与靶向治疗，都离不开分子之间特异性的识别与结合以及相应的试剂或药物。1990年，一种制备特异性寡核苷酸分子的技术问世，这种被称为SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)的技术，经过富集的核酸分子可以形成多种稳定的次级结构，如茎环发夹、假结和口袋等，与靶分子形成空间互补，通过静电作用、范德华力以及氢键等分子间作用力，而与靶分子紧密地、特异性地结合呈一定的三维结构，它们可以识别不同靶分子之间极微小的差异，比如有无羟基等小的基团和手征差异适配体的靶分子可以是蛋白质，也可以是核酸、小分子有机物或金属离子，适配体亦可与病毒或细胞结合能与靶分子通过立体构象之间的适应性互补（并非碱基配对）。

指数富集的配体系统进化（SELEX）技术的基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左右。将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基（aptamer），经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。利用上述原理建立的SELEX技术已经成功获得多种靶分子的特异核酸适配子。SELEX技术打破了传统的核苷酸碱基配对的思路，称得上核酸研究与应用上的里程碑。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与抗体类似，但与蛋白质类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并易于长期保存和室温运输等。这些特性使得 aptamer在生物医药研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。

从1990年Gold等建立SELEX技术至今，SELEX技术和aptamer的研究不断受到新的挑战与更新。经过15年的发展，SELEX技术不断得到改进与完善，实现了筛选流程的自动化、筛选形式的多样化、筛选结果的快速化，aptamer也有了多种应用形式。

消减SELEX是一种改良SELEX技术（Wang C, et al. J Biotechnol; 2003, 102:15-22），其原理是在筛选过程中扣除能与已知或未知的共有靶分子的寡核苷酸配基，消减后的次级随机文库投入特异靶标的筛选。利用消减SELEX 技术可以从两组高度同源的靶分子混合物中筛选获得差异靶分子的特异aptamer。但是消减SELEX实验中需要提前建立与目的靶高度同源的筛选靶，验证限制了消减SELEX的应用范围。

加尾 SELEX（tailor ed SELEX）是通过构建随机文库（Vater A, et al. NucleicAcids Res; 2003, 31(21): e130），两端各含有4 nt和6 nt的固定序列，用于与接头序列连接搭桥。合成文库两端的单链连接序列含有T7启动子序列、可用碱裂解的碱基以及便于文库扩增的序列。合成的单链接头序列，能够与上述连接序列和文库的固定序列退火，形成搭桥，用于PCR扩增。如此，筛选过程中仅投入随机文库，在筛选后通过连接、搭桥的方式加入两端连接序列与接头序列，PCR扩增后再经碱裂解处理去除两端序列，投入下一轮筛选。但是由于操作较为复杂，因此未能得到很好的推广和应用。