[发明专利]一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述HFRS病毒样颗粒上融合RGD短肽。

2.根据权利要求1所述的一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述RGD短肽插入到HFRS病毒样颗粒的M片段区。

3.根据权利要求1所述的一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒，其特征在于，所述融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒是通过构建原核表达载体pET30a-RGD-HFRS原核蛋白表达获得。

4.一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. mRNA的提取 按照mRNA小量制备试剂盒说明书进行操作，最终根据OD260/OD280比值确定RNA的纯度和浓度；

S2. 逆转录反应合成cDNA 按照RT-PCR试剂盒说明书操作，在冰上操作；

S3. PCR扩增HFRS目的片段 按照PCR试剂盒说明书操作，在冰上配制PCR反应体系；

S4. 双酶切 配置酶切反应体系，将酶切体系在37 ℃孵育1 h，加入10 × Loading buffer终止反应；

S5. 酶切产物的连接 配置10 μL连接反应体系，吹打混匀连接反应液，瞬时离心将溶液收集到管底，在 16 ℃下连接过夜；

S6. 重组产物鉴定 经PCR和质粒双酶切的鉴定实验后，将连接产物pET-30a-HFRS进行测序鉴定；

S7. PCR扩增RGD基因片段 设计引物，配制PCR反应体系，置于PCR仪上；

S8. 重组质粒的转化 解冻感受态细胞，加入连接产物，于冰上放置30 min，

加入预热的水浴中的LB液体培养基900 μL，于37 ℃下，在摇床上转速为40 rpm转动45~60 min，弃去上清，留约100 μL，缓慢吹匀，涂板，在恒温箱中于37 ℃下，倒置过夜培养；

S9. 诱导表达 挑取含表达载体pET-30a质粒的大肠杆菌BL21单菌落，在LB培养基中培养至OD600值为0.4~0.6之间结束；加入100 μL 0.1 mol·L-1 IPTG，使其工作浓度为 0.1 mmol·L-1，恒温摇床中，25 ℃下250 rpm，开始诱导，诱导至4h时取出菌液12,000 rpm 离心1 min富集到离心管中，弃尽上清，加入1 mL 破菌缓冲液以洗涤沉淀，使用移液器彻底吹打悬浮，12,000 rpm 离心1 min，弃尽上清，加入500 μL 破菌缓冲液；细胞超声破碎仪破碎后离心分离，取上清于一新的离心管中，上清液中既含有融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒。

5.根据权利要求4所述的一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中反应体系为：

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6.根据权利要求4所述的一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中PCR反应体系为：

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7.根据权利要求4所述的一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中PCR反应条件为：

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8.根据权利要求4所述的一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中双酶切反应体系为：

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9.根据权利要求4所述的一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中酶切产物的连接反应体系为：

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10.根据权利要求4所述的一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中的PCR反应体系为：

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