[发明专利]一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒基因工程领域，特别涉及一种融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法。

背景技术

病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)，是一种不含有病毒基因组的纳米颗粒，可由全部或部分病毒结构蛋白自组装构成，是一种非病毒载体。许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。目前，至少有30种VLPs已经在文献中报道这些VLPs在生物医学各个领域发挥重要作用，大多作为疫苗载体研究，也可作为病毒感染途径研究或是作为纳米颗粒应用。

汉坦病毒为单负链RNA病毒，直径为80-210nm，平均直径为120nm，呈圆形或卵圆形，有双层膜，内浆为疏松的颗粒性线状结构。汉坦病毒基因组有L、M和S三个片段，长度约6.5Kb，3.6Kb和1.7Kb，三个基因片段均由单一的长开放读码框架组成，分别以病毒RNA为模板从3’-5’方向转录相对应的mRNA(3’-5’)，然后翻译合成相对应的基因产物即病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(L)，包膜糖蛋白(G1和G2)，病毒核壳蛋白(NP)。汉坦病毒膜蛋白构成病毒最外层包膜表面镶嵌的刺突，存在血凝素抗原和中和抗原决定簇，可诱导寄主产生中和抗体，具有保护作用。

肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)均是由汉坦病毒属病毒引起的急性传染病。HFRS的病原体(汉坦病毒、汉城病毒、普马拉病毒和多布拉伐病毒等)主要分布于有着几千年文明历史的欧亚大陆，在国际上多称为旧世界汉坦病毒；而辛诺柏病毒、安弟斯病毒等HPS的病原体主要分布于仅有几百年文明史的南北美洲新大陆，故也称为新世界汉坦病毒。肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒引起的急性病毒性传染病，以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。主要表现为发热、出血、充血、低血压休克及肾脏损害。该病危害严重，病死率高，中国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家，目前，对于该病尚无特异有效的治疗药物，主要靠疫苗进行预防。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽，广泛存在于生物体内，作为配体相互作用的识别位点，介导小分子核酸及细胞之间的相互作用。

笔者通过反复的生物学假设和实验方法，最终得到通过使汉坦病毒样颗粒携带RGD肽作为药物靶向配体，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害，此外，利用原核表达载体降低操作难度，使该方法更好的适于工业生产。

发明内容

鉴于以上问题，本发明提供了一种携带RGD肽的汉坦病毒样颗粒，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明中一种肿瘤基因治疗中使用的融合RGD的汉坦病毒样颗粒及其制备方法，所述HFRS病毒样颗粒上融合RGD短肽。

优选的，所述RGD短肽插入到HFRS病毒样颗粒的M片段区。

优选的，所述融合RGD短肽的HFRS病毒样颗粒是通过构建原核表达载体pET30a-RGD-HFRS原核蛋白表达获得。

一种融合RGD汉坦病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

S1.mRNA的提取按照mRNA小量制备试剂盒说明书进行操作，最终根据OD260/OD280比值确定RNA的纯度和浓度；

S2.逆转录反应合成cDNA按照RT-PCR试剂盒说明书操作，在冰上操作；

S3.PCR扩增HFRS目的片段按照PCR试剂盒说明书操作，在冰上配制PCR反应体系；

S4.双酶切配置酶切反应体系，将酶切体系在37℃孵育1h，加入10×Loading buffer终止反应；

S5.酶切产物的连接配置10μL连接反应体系，吹打混匀连接反应液，瞬时离心将溶液收集到管底，在16℃下连接过夜；

S6.重组产物鉴定经PCR和质粒双酶切的鉴定实验后，将连接产物pET-30a-HFRS进行测序鉴定；

S7.PCR扩增RGD基因片段设计引物，配制PCR反应体系，置于PCR仪上；

S8.重组质粒的转化解冻感受态细胞，加入连接产物，于冰上放置30min，