[发明专利]用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用

说明书

本发明提供了一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用，涉及生物检测技术领域，本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，包括具有反应区、互补区和染料结合区的第一多肽探针和第二多肽探针，具有特异性强、准确度好、灵敏度高的优点，无需进行修饰或标记处理，就能够达到测定转肽酶A活性的目的。本发明提供的测定转肽酶A活性的方法，包括将上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对与待测样本于转肽反应缓冲液中混合并孵育，再用双砷染料来标记孵育后的反应产物，通过孵育后的反应产物与双砷染料结合形成复合物的荧光水平来判定转肽酶A的活性，操作简单、方便。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用。

背景技术

细菌表面蛋白在病原菌的感染过程(如粘附、免疫逃逸、生物膜形成) 中发挥重要作用，是决定病原菌感染严重性不可缺少的致病因素(Nat.Rev. Microbiol.,2014,12,49-62)。在革兰氏阳性细菌中，表面蛋白正确锚定到细胞壁需要转肽酶所催化的转肽反应。通常，表面蛋白以前体的形式被合成出来，前体蛋白的N端包含有一个分泌信号肽，C端包含有一个LPXTG(X 代表任意一种氨基酸)结构域，一个疏水区以及一个带正电荷残基的末端。 N端的信号肽会指引前体蛋白通过分泌途径运送至细胞外，在分泌过程中， N端的信号肽会被切除，C端的疏水区和正电荷尾部会将表面蛋白前体保留在胞膜内。随后，结合在细胞膜上的转肽酶会切割LPXTG氨基酸序列中苏氨酸和甘氨酸之间的共价键，形成一个硫酯酶中间体，硫酯酶中间体会被 II型类脂上游离的氨基亲核攻击，将表面蛋白共价结合到肽聚糖的交连桥上，脂连接的表面蛋白进一步通过转糖苷作用和转肽作用整合到细胞壁上。通过这一作用方式，转肽酶将20多种毒力因子蛋白锚定到细菌细胞壁上。转肽酶基因的缺失或转肽酶活性的丧失会导致多种表面蛋白不能定位到细菌表面，并且会降低细菌的感染能力和粘附能力。但是转肽酶并不是细菌生存与生长所必需的，抑制转肽酶的活性不会对病原菌带来生存压力从而产生耐药性，因此转肽酶成为抗感染新药研发的理想药物靶标。

当前，有多种方式来对转肽酶活性进行测定，其中最常用的是荧光淬灭活性检测法，该方法需要在LPXTG基序的一端修饰一个荧光基团，在另一端修饰一个淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间由于发生荧光共振能量转移因而会淬灭荧光基团的信号，转肽酶对底物的切割作用会将淬灭基团和荧光基团分离开来，从而恢复荧光基团的荧光特性。对于荧光淬灭活性检测法，主要存在两个问题：一是需要对底物进行标记，二是只能测定转肽酶的切割活性，而不能测定其转肽能力。此外，纤连蛋白结合法、HPLC-MS 检测法、基于酵母表面展示的荧光测定法也被用来测定转肽酶的活性，纤连蛋白结合法具有操作繁琐、检测特异性不好等缺点，HPLC-MS检测法需要昂贵的仪器和专业的操作，基于酵母表面展示的荧光测定法虽然可以来高通量筛选靶向转肽酶的抑制剂，但是检测灵敏度有限。这极大限制了“非抗生素类”药物的研发进程。

因此，迫切需要开发一些简单、高效、灵敏的方法来测定转肽酶的活性，加速非抗生素类抗感染新药的研发。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，以缓解现有技术中存在的用于测定转肽酶A活性的多肽探针均需要进行标记、制备繁琐、灵敏度有限的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种测定转肽酶A活性的方法，以缓解现有技术中存在的测定转肽酶A活性的方法操作繁琐、灵敏度较低、需要专业技术人员才能实现的技术问题。

本发明的第三个目的在于提供上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对或测定转肽酶A活性的方法在测定革兰氏阳性菌潜在致病能力中的应用。

本发明提供了一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，所述多肽探针对包括第一多肽探针和第二多肽探针；