[发明专利]可降解二维黑磷作为基因编辑载体的应用

说明书

本发明公开了可降解二维黑磷作为基因编辑载体的应用。本发明的基因编辑运载体系，如二维黑磷‑CRISPR/Cas9复合材料等，可以通过细胞内吞作用进入细胞，二维黑磷载体在溶酶体内逐步降解，从而将CRISPR/Cas9体系释放到细胞质中，该体系进而转运至细胞核来发挥定向基因编辑的功能，在此过程中可以很好地保持CRISPR/Cas9体系等基因编辑体系的生物活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因编辑领域，具体涉及基因编辑体系的高效运载技术。

背景技术

CRISPR/Cas9技术源自于细菌的获得性免疫，用于抵御外源遗传物质入侵，作为一种基因定点编辑技术，其主要通过内切酶Cas9和特异识别靶DNA的引导RNA(single guideRNA,sgRNA)结合起来发挥功能，CRISPR/Cas9对靶DNA的编辑过程如下：1)Cas9-sgRNA复合体特异识别与sgRNA互补的具有PAM序列(Protospacer Adjacent Motif)的靶DNA，2)Cas9对靶DNA进行切割，产生双链断裂(double-stranded DNA break，DSB)，3)细胞通过自身DNA修复机制对切口进行修复而达到基因编辑的效果。

利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑的效率，通常取决于转运CRISPR/Cas9体系进入细胞的方式，待转运的CRISPR/Cas9体系主要包括编码Cas9/sgRNA的质粒、mRNA、Cas9蛋白及预组装的Cas9-sgRNA核酸蛋白复合体等。其中Cas9蛋白对环境敏感，容易失活，同时分子量较大(160KD)，常规方式效率低下，严重影响了基因编辑效果。

对于CRISPR/Cas9体系的细胞转运，病毒载体表现出较高的转运效率，但是病毒转运前期准备复杂，且存在生物安全因素，因而通常采用以下几种非病毒转运方式：

电穿孔介导CRISPR/Cas9体系进入细胞：通过脉冲电流作用细胞膜产生空洞而转运CRISPR/Cas9体系进入细胞内部，方法简单，普适性高，但是仪器要求高，同时存在较高的细胞致死率，需要大量的细胞以及CRISPR/Cas9体系才可以短暂或者稳定地进行转运。

阳离子脂质体介导CRISPR/Cas9体系进入细胞：脂质体包裹CRISPR/Cas9体系，通过细胞融合的方式将复合体转运到细胞内，表现出较高的转染效率，但是阳离子脂质体对细胞有较高的毒性，同时价格昂贵。

显微注射介导CRISPR/Cas9体系进入细胞：可以通过微细玻璃管直接将CRISPR/Cas9体系注射进入细胞，但是需要精密的仪器设备，同时转染细胞数量有限。

黑磷纳米片作为一种新型二维纳米层状材料，在生物医药领域受到广泛关注，其本身可以作为造影剂进行光声成像，也可以作为光敏剂用于肿瘤光动力治疗和光热治疗。而近年来，二位纳米材料作为载体进行药物输送是当前生物医药领域的研究热点，但一些二维纳米材料因为引入过渡金属以及表面修饰，且不可降解，从而在体内富集而引发一系列的组织器官毒性，而二维黑磷纳米片因为其所特有的生物可降解性，良好的组织相容性以及高效的药物负载能力，使其在药物运载领域表现出很大的潜能。然而其对大分子，特别是生物活性大分子的细胞内运载尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备简单，转运效果好的基因编辑载体及其相应的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

可降解二维黑磷作为基因编辑载体的应用，基因编辑载体为可降解二维黑磷纳米片。

作为上述应用的进一步改进，可降解二维黑磷选自裸露的二维黑磷或修饰的二维黑磷中的至少一种。

作为上述应用的进一步改进，修饰的二维黑磷包括共价、配位修饰或高分子包裹的二维黑磷等。

作为上述应用的进一步改进，可降解二维黑磷纳米片的厚度为1～10nm。