[发明专利]一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用在审
| 申请号： | 201711444512.7 | 申请日： | 2017-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN108179151A | 公开（公告）日： | 2018-06-19 |
| 发明（设计）人： | 王雷;凌红丽;魏波;曲信芹;刘晓婧;孙亚磊;蒋贻海;王艳玲;王宏华;于春梅;蒋皓静;武利利 | 申请（专利权）人： | 青岛蔚蓝生物股份有限公司;青岛动保国家工程技术研究中心有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/21;C12N1/21;C07K14/56;A61K38/21;A61P31/12;A61P35/00;A61P37/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 青岛清泰联信知识产权代理有限公司 37256 | 代理人： | 李祺;高洋 |
| 地址： | 266000 山东省青岛市崂山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组猪α -干扰素 干扰素 制备 畜禽病毒性传染病 高抗病毒活性 基因工程领域 治疗畜禽病毒 大肠杆菌 干扰素基因 干扰素效价 抗病毒活性 变性纯化 有效应用 诱导表达 包涵体 内切酶 性疾病 复性 位点 应用 优化 克隆 预防 转化 | ||
1.一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
选择GenBank登录号为28623的猪α-干扰素基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
翻译SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子进行优化，消除常规限制性内切酶酶切位点，并对其RNA二级结构进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列两端分别加入NdeI和EcoRI位点并克隆到pGEM-Teasy载体中，挑取阳性克隆后进行测序鉴定，得到质粒pGEM-pigIFNa1；
利用NdeI和EcoRI限制性内切酶将质粒pGEM-pigIFNa1中的猪干扰素pigIFNa1切下，琼脂糖凝胶电泳回收523bp片段，克隆到预先以NdeI和EcoRI限制性内切酶酶切的氨苄青霉素抗性载体中，挑取阳性克隆进行测序鉴定，得到重组质粒pET23-pigIFNa1；
将重组质粒pET23-pigIFNa1转化感受态大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，收集表达菌体，经超声破碎后，得到包涵体，将所得包涵体洗涤、变性、复性，再经亲和层析纯化，得到重组猪α-干扰素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在得到优化后的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列之后，还包括将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比对的步骤，以及将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列翻译为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，并将其与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对的步骤。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对结果一致。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，洗涤步骤包括：将包涵体依次经1％Triton X-100及2M尿素重悬洗涤；变性步骤包括：将1g纯化的包涵体在40ml 7M盐酸胍溶液中完全变性，变性液中蛋白含量为8～10mg/ml；复性步骤包括：将变性蛋白溶液逐滴缓慢加入胱氨酸-半胱氨酸复性液中，使蛋白含量约为0.1mg/ml，4℃静置复性24-40小时。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的重组猪α-干扰素，其特征在于，采用MDBK-VSV系统检测其活性不低于1010U/mg。
6.一种含有如权利要求5所述的重组猪α-干扰素的药物。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物为抗病毒、抗细胞增殖和增强免疫功能的药物。
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