[发明专利]一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用

说明书

本发明提出一种重组猪α‑干扰素、其制备方法及其应用，属于基因工程领域，该重组猪α‑干扰素具有高抗病毒活性，可有效应用于畜禽病毒性传染病防控方面。该技术方案包括通过对猪α‑干扰素基因优化、RNA二级结构优化及某些常见内切酶位点消除后克隆至pET‑23b(+)载体上转化大肠杆菌进行诱导表达，经包涵体分离变性纯化复性后，获得重组猪α‑干扰素。本发明提供的重组猪α‑干扰素效价很高，抗病毒活性可达10¹⁰U/mg，能够有效应用在预防和治疗畜禽病毒性疾病方面。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用。

背景技术

近来，病毒性传染病日益泛滥，已严重威胁我国畜牧业的持续发展。免疫抑制病及病毒抗原快速变异，常导致疫苗免疫失败，加之不断出现新的病毒病，目前还尚无成功的疫苗接种预防。另一方面，疫苗对疾病只有预防作用，治疗还有赖于抗生素的使用。而一些抗药性菌株的出现，给人类食品和健康带来极大的威胁，一些国家已命令禁止在养殖生产中应用某些抗生素和抗菌剂。因此，生产中迫切需要一种既有效又有利于环保的新方法来防控畜禽疾病。实践证明，干扰素作用一种广谱的抗病毒剂，在病毒性传染病的防控方面具有广阔的应用前景。

猪α-干扰素是动物在特定诱导剂如某种病毒作用下产生的一类具有广谱高效抗病毒作用的细胞因子，其作用机理是诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，从而减少病毒增殖。猪α-干扰素对猪的传染性胃肠炎、流行性腹泻、蓝耳病等均有一定疗效，但其在抑制病毒试验中使用α-干扰素时并没有发现在同样较高浓度使用其它动物型干扰素时所表现出的细胞毒性。因此，如何提供一种具有高活性的猪α-干扰素将是本领域目前需要研究的课题。

发明内容

本发明提出一种重组猪α-干扰素、其制备方法及其应用，该重组猪α-干扰素具有高抗病毒活性，可有效应用于畜禽病毒性传染病防控方面。

为了达到上述目的，本发明的一方面提供了一种重组猪α-干扰素的制备方法，包括以下步骤：

选择GenBank登录号为28623的猪α-干扰素基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

翻译SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子进行优化，消除常规限制性内切酶酶切位点，并对其RNA二级结构进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列两端分别加入NdeI和EcoRI位点并克隆到pGEM-T easy载体中，挑取阳性克隆后进行测序鉴定，得到质粒pGEM-pigIFNa1；

利用NdeI和EcoRI限制性内切酶将质粒pGEM-pigIFNa1中的猪干扰素pigIFNa1切下，琼脂糖凝胶电泳回收523bp片段，克隆到预先以NdeI和EcoRI限制性内切酶酶切的氨苄青霉素抗性载体中，挑取阳性克隆进行测序鉴定，得到重组质粒pET23-pigIFNa1；

将重组质粒pET23-pigIFNa1转化感受态大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，收集表达菌体，经超声破碎后，得到包涵体，将所得包涵体洗涤、变性、复性，再经亲和层析纯化，得到重组猪α-干扰素。

作为优选，在得到优化后的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列之后，还包括将SEQID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比对的步骤，以及将SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列翻译为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，并将其与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对的步骤。

作为优选，其中，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比对结果一致。