[发明专利]一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用

权利要求书

1.一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用；

该应用方法包括以下步骤：1)在载体上包被能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的包被抗体A；2)加入被测抗原生物蛋白标记物，使被测抗原生物蛋白标记物与固定在载体上的包被抗体A特异性结合；3)加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B，使标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合；4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液，过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号，通过检测检测液的荧光强度实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测；

步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的组成为：有机溶剂10-90％(V/V)，水90-10％(V/V)，有机溶剂与水的体积和为100％(V/V)；最终浓度在1-1000μM的氧化还原荧光探针分子；最终浓度为10-1000mM的甲酸；最终浓度为10-1000mM的甲酸钠；pH为3-10；上述有机溶剂为二甲基亚砜DMSO、N，N-二甲基甲酰胺DMF、乙醇、甲醇、乙腈或二氧六环中的一种或二种以上；

所述的过渡金属催化剂为羧基修饰五甲基环戊二烯基铱络合物六氟磷酸盐[(η₅-C₅Me₅)Ir(bpyCOOH)(H₂O)](PF₆)₂，荧光探针为氧化还原调控型探针，分子结构为：

或所述的过渡金属催化剂为五甲基环戊二烯基铱络合物氟硼酸盐[(η₅-C₅Me₅)Ir(bpymCOOH)(H₂O)](BF₄)₂，荧光探针为氧化还原调控型探针，分子结构为：

或所述的过渡金属催化剂为五甲基环戊二烯基钌络合物氟硼酸盐[(η₅-C₅Me₅)Ru(bpymCOOH)(H₂O)](BF₄)₂，荧光探针为氧化还原调控型探针，分子结构为：

或所述的过渡金属催化剂为五甲基环戊二烯基铑络合物氟硼酸盐[(η₅-C₅Me₅)Rh(bpymCOOH)(H₂O)](BF₄)₂，荧光探针为氧化还原调控型探针，分子结构为：

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：步骤1)所述载体为聚苯乙烯酶标板或磁珠；所用磁珠包含氨基磁珠、羧基磁珠、环氧磁珠、生物素链霉亲和素磁珠中的一种或二种以上，其中氨基磁珠或羧基磁珠负载蛋白前需首先采用戊二醛或水溶性的碳二亚胺缩合剂进行活化。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于：步骤3)中所述过渡金属催化剂修饰的方法为：取过渡金属催化剂溶于10-100mM的磷酸缓冲溶液中，使过渡金属催化剂浓度为0.01-1.00mg/mL，调节pH为7.2-7.5，加入终浓度为0.5-2.0mg/mL的NHS，向上述体系中加入5mg·mL^-1标记抗体B，加入量为每10mL所述体系加入标记抗体B1-5μL，摇床混合12-24h；向所得体系中分别加入1-5％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)和1-5％(v/v)的甲酸，每10mL所述体系二者加入量均为200μL，25℃摇床上混合12h，得到过渡金属催化剂标记抗体溶液，置于4℃条件下保存备用。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于：步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的配制方法为：将氧化还原荧光探针分子溶于有机溶剂与水的混合溶剂中，所述的混合溶剂含10％-90％V/V的有机溶剂，使氧化还原荧光探针分子的最终浓度保持在1-1000μM，向混合溶剂中分别加入甲酸和甲酸钠，保持溶液中甲酸和甲酸钠的最终浓度均为10-1000mM，调节混合液pH＝3-10；各成分超声混合均匀后，置于4℃条件下保存备用；上述有机溶剂为二甲基亚砜DMSO、N，N-二甲基甲酰胺DMF、乙醇、甲醇、乙腈或二氧六环中的一种或二种以上。