[发明专利]一种KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法

权利要求书

1.一种KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测引物组，其特征在于，包括如下引物：

上游引物rs17401966-F：5`-ACGTTGGATGAATTGCACCTTGGTAGTCCC-3`；

下游引物rs17401966-R：5`-ACGTTGGATGAACCTCTAAGAACACTTGAC-3`；

延伸引物rs17401966-E：5`-GTGCCTCTATGAGTCC-3`。

2.一种应用权利要求1所述引物组的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：用上游引物rs17401966-F和下游引物rs17401966-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，得到含有所述rs17401966位点的片段；

S2：对步骤S1得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；

S3：用延伸引物rs17401966-E对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对SNP碱基序列进行扩增，从而实现不同SNP的分型；

S4：对步骤S3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测。

3.如权利要求2所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S1中，第一轮PCR的反应体系中包括如下组分：

模板DNA 2ng/μl、rs17401966-F引物0.05μM、rs17401966-R引物0.05μM、Mg2+4mM、1×PCR Buffer、dNTP 10μM以及Taq DNA聚合酶1U。

4.如权利要求3所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S1中，第一轮PCR的反应条件如下：

(1)预变性：95℃ 2min；

(2)扩增：95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，共45个循环；

(3)延伸：72℃ 5min，4℃ ∞。

5.如权利要求2所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S2中，去磷酸化的反应体系在第一轮PCR扩增产物的基础上还包括如下成分：

0.24×SAP Buffer以及SAP酶0.5U。

6.如权利要求5所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S2中，去磷酸化的反应条件如下：

(1)去磷酸化：37℃40min；

(2)SAP酶灭活：85℃5min，4℃∞。

7.如权利要求2所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S3中，单碱基延伸的反应体系在去磷酸化产物的基础上还包括如下成分：

0.222×iPLEX GOLD Buffer、1×iPLEX Termination mix、iPLEX延伸引物混合物0.84～1.57μM以及1×iPLEX Enzyme。

8.如权利要求7所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S3中，单碱基延伸的反应条件如下：

(1)预变性：94℃ 30s；

(2)扩增内循环：94℃ 5s，52℃ 5s，共5个循环；

(3)扩增外循环：94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，共40个循环；

(4)延伸：72℃ 4min，4℃ ∞。

9.如权利要求2所述的KIF1B基因rs17401966位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S4包括如下步骤：

S4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；

S4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μL ddH2O，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。