[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的靶向肿瘤的基因治疗药物及其用途

权利要求书

1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除人DNMT1基因中特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，其特征在于：

(1)所述的sgRNA结合在人DNMT1基因靶序列的规律为5’-GN(18-21)GG，其中3’-NGG为PAM；

(2)所述的sgRNA结合在人DNMT1基因的第31和32外显子上。

2.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除人DNMT1基因中特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA在人DNMT1上的靶位点序列如SEQ ID NO.1-7任一序列所示。

3.根据权利要求2所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除人DNMT1基因中特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA在人DNMT1上的靶位点序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。

4.一种将权利要求1～3任一项所述的sgRNA装载到Cas9质粒载体构建而成的靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒，其特征在于，所述的Cas9质粒载体选自PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462中任意一种。

5.一种制备如权利要求4所述的靶向敲除人DNMT1基因的sgRNA/Cas9质粒的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)将Cas9质粒载体经限制性内切酶酶切后形成线性Cas9质粒载体；

(2)权利要求1～3任一项所述的sgRNA，在所述的sgRNA及其互补链的5’端添加符合步骤(1)中限制性内切酶酶切方式的接头，分别合成sgRNA正向寡核苷酸(forward oligo)和反向寡核苷酸(reverse oligo)，并且在反应体系中进行磷酸化，然后经过变性、退火，制备为可以载入到上述步骤(1)所得到的线性Cas9质粒载体中的双链寡聚核苷酸；

(3)将所述步骤(2)制备得到的sgRNA双链寡聚核苷酸通过连接酶连接到所述步骤(1)制备得到的线性Cas9质粒载体中，得到sgRNA/Cas9质粒。

(4)将所述步骤(3)制备得到的sgRNA/Cas9质粒在感受态细胞中进行转化，PCR法筛选阳性克隆，得到可用于特异性敲除人DNMT1的sgRNA/Cas9质粒。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的Cas9质粒载体选自PX330、PX458、PX459、PX460、PX461或PX462中任意一种，所述的限制性内切酶是Bbs Ⅰ酶；所述步骤(2)中在所述的sgRNA5’端所添加的接头是CACCG，在所述的sgRNA互补链的5’端所添加的接头是AAAC，所述的变性，其条件是95℃，5～10min；所述的退火，条件是温度降至37～40℃；所述步骤(3)中的连接酶是T4连接酶，所述的线性Cas9质粒载体的质量为20～50ng，所述的sgRNA双链寡聚核苷酸是经步骤(2)得到的sgRNA双链寡聚核苷酸稀释后的，其稀释倍数为1:100～1:200；所述步骤(4)中感受态细胞选自Top10或DH5a细胞。