[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的靶向肿瘤的基因治疗药物及其用途

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其在指导CRISPR/Cas9系统在治疗和/或预防肿瘤药物中的用途，及对应构建所述sgRNA表达载体的方法，所述的CRISPR/Cas9系统可以快速高效、特异性敲除人DNMT1基因，促使肿瘤细胞中DNMT1基因失活，抑制DNMT1的表达及其对DNA的甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞生长。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，特别涉及基于CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其CRISPR/Cas9载体，以及该特异性靶向敲除DNMT1基因的CRISPR/Cas9系统在制备为肿瘤基因治疗药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。据目前最新癌症统计学数据显示，全球癌症患者每年新发病例为1700万，死亡人数为900万例；2015年我国癌症新发病例数及死亡人数分别为429.2万例和281.4例，发病率也呈明显年轻化趋势。虽然过去20～30年间，传统治疗手段包括放射治疗、化学治疗和手术治疗不断发展，在癌症的治疗中取得了一定疗效，但是新的治疗药物以及新技术的应用仍未能改善癌症患者生存质量和提高患者生存期。

基因治疗是指通过操作遗传物质(包括人类自身的或外源的)来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱、杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等。基因治疗能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能解决的疾病，在疾病的治疗和预防方面发挥着重要作用。因此，基因治疗作为肿瘤治疗的新兴手段之一，与传统治疗方式相比，具有显著的优越性。多数基因治疗药物具有良好的安全性、抑瘤率较高，受试个体耐受性好、存活率高，因此有望作为术后放化疗的替代治疗，或者与一线化疗药物联用，以降低化疗药物的治疗剂量和毒副作用，提高癌症的治疗效果。

肿瘤基因治疗的核心是利用载体系统向机体导入具有功能性的基因或导入 RNA等，以抑制肿瘤相关基因的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡、增强其对放化疗的敏感性，或者提高机体对肿瘤细胞特异性免疫应答能力。

表观遗传学调控机制的改变，例如DNA甲基化，与多种癌症的发生和进展相关。DNA甲基化反应是指在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase， DNMT)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)分子上的甲基基团被转移到胞苷的嘧啶环第5位碳原子上，形成甲基化胞嘧啶。哺乳动物中DNA甲基化修饰通常发生在5’-CpG-3’序列的胞嘧啶，基因组中富含CpG序列的部位称为CpG岛，多位于某些启动子区、第一外显子和基因3’-末端。CpG岛的胞嘧啶甲基化后，突入DNA主沟内，阻碍转录因子与启动子结合而抑制转录；也可通过募集甲基化 CpG结合蛋白(MeCP)结合在甲基化的CPG岛上，使染色质结构紧密，阻止转录因子与启动子结合，从而阻碍转录。由此可见，DNA的甲基化与基因的转录呈负相关，甲基化程度越高，基因的表达越低。研究发现，肿瘤细胞中的部分抑癌基因启动子区域CpG岛过度甲基化，导致抑癌基因不表达，进而促使肿瘤的发生和发展。DNA甲基转移酶作为DNA甲基化过程中关键的酶，目前哺乳动物中DNMT家族有5个成员，分别是DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L。然而只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B 3种酶具有甲基转移活性，其中DNMT1在哺乳动物中的含量最高，是调节DNA甲基化最重要的酶，主要在细胞分裂过程中参与甲基化的维持性，可以在甲基化的DNA模板指导下使新合成的DNA链发生甲基化。已经证明在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、白血病等多种人恶性肿瘤中DNMT1的表达异常增高，且通过DNMT1介导的基因失活促使肿瘤的进展。

因此，调控肿瘤细胞DNMT1已成为近年肿瘤治疗研究的热点和趋势。目前，靶向DNMT1的小分子抑制，如5-氮杂胞苷和地西他滨，作为骨髓增生异常综合征(MDS)的一线用药，尽管在临床治疗中取得了一定疗效，但治疗过程中选择性差，毒性大，以及仅对小部分患者有效等问题，因此，亟需开发针对DNMT1 疗效更为明确的基因治疗药物。由于传统的肿瘤基因治疗药物缺乏对目的基因进行持久、特异性的作用，限制其在临床中的广泛应用。