[发明专利]一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1：分离：取合格的胎盘，将胎盘用无菌盐水冲洗后，小心分离胎盘和羊膜，加入华尔通胶，剪碎成组织小块。

步骤2：初处理：洗去组织小块中的血液成分，剔除组织小块上的血管组织和滋养层组织，再加入胶原酶，置于37℃恒温振荡培养箱振荡消化。

步骤3：过滤和离心：将消化后得到的混合液体经过滤网过滤掉不溶物质，将滤过的细胞悬液离心洗涤。

步骤4：接种和培养：加入UltraCULTURE无血清培养液用以混合细胞，以1.0×105/cm²将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、3～8％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。

步骤5：传代：等到细胞贴壁后，每隔3～5d换液。待细胞生长至80～90％融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代。

步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×10⁷/ml/管放入细胞冻存管，加入冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；

步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得间充质干细胞，按照需求使用即可。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中剪碎成组织小块的大小为0.6～1.0mm³。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述加入的胶原酶为Ⅳ型，浓度为0.8～1.2g/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中放入恒温振荡培养箱振荡消化的时间3h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的滤网为80目滤网。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的离心的条件为800～1500r/min,3～10min。

7.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤4中胎牛血清的含量为6～15％。

8.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤5中加入胰酶的时机是细胞生产至85％。

9.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤5中，进行传代的比例为1:3或者1:2。

10.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6中，冷冻保存所用的细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度8％。