[发明专利]一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法：步骤1、分离；步骤2、初处理；步骤3、过滤；步骤4、接种和培养；步骤5、传代；步骤6、细胞冻存；步骤7；细胞复苏。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、系统监控，从胎盘组织采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种应用于绝经期综合征的间充质干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)(专能干细胞)。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。

卵巢功能早衰是指女性曾有自然的月经周期，而在40岁之前出现卵巢萎缩性持续闭经。病因可能为感染、医源性卵巢早衰、特发性卵巢早衰和免疫因素等。

同时，临床上表现第二性征退缩，出现颜面烘热、心烦、易怒等更年期症状；平时易感冒，血卵泡刺激素水平升高，达40单位以上，相当于绝经后妇女水平；而血雌二醇水平显著低落。妇科检查内生殖器明显萎缩，阴道粘膜薄而充血。剖腹作卵巢活组织检查，可见卵巢萎缩，显微镜下见卵巢皮质内均为纤维组织，无始基滤泡等各级滤泡可见。

卵巢早衰一般认为是自身免疫性疾病，可能是病毒感染引起的机体对自身卵巢组织的免疫性卵巢炎。凡免疫性疾病引起的都并见自身免疫现象，或同时存在一种以上的疾病，表现于多腺体衰竭综合征。由于卵巢自身免疫者的血清中存在一种抗卵巢抗体，因而卵巢活检可见淋巴细胞浸润。有因手术、放疗影响卵巢血运而致的。有因卵泡先天性过少或促性腺素过度刺激加速卵泡闭锁而致的。卵巢早衰治疗比较困难，西医临床上采用激素替代疗法，需要在大夫的指导下使用雌孕激素；研究表明该雌激素和孕激素治疗的时候，有一定的作用，可以改善症状，但对卵巢功能的恢复并不理想，同时停药之后症状重新出现，使卵巢处于依赖状态，有导致卵巢功能更差的可能，也就是说激素替代疗法仅仅起到了治标的作用，而且这种方法副作用大，长期使用外源性激素有导致子宫内膜癌变的危险，并增加冠心病以及胆囊病的发病率。因此，该激素治疗的效果不理想，同时存在安全隐患。

围绝经期综合征出现的根本的原因是由于生理性或病理性或手术而引起的卵巢功能衰竭。卵巢功能一旦衰竭或被切除和破坏，卵巢分泌的雌激素就会减少。女性全身有400多种雌激素受体，分布在几乎女性全身所有的组织和器官，接受雌激素的控制和支配，一旦雌激素减少，就会引发器官和组织的退行性变化，出现一系列的症状。