[发明专利]由干细胞制备心外膜细胞的方法

权利要求书

1.由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外膜细胞；以及4)由步骤3)中获得的前心外膜细胞制备心外膜细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞，优选地，所述人多能干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中的激活WNT信号通路是通过添加WNT信号通路配体如WNT3a，或添加GSK-3抑制剂如CHIR99021、BIO，或添加与Axin有关的激动剂如HLY78来实现的，优选地，是通过添加CHIR99021来实现的。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中的抑制WNT信号通路是通过添加内源性的WNT抑制因子如DKK1，或添加控制WNT信号和分泌的抑制剂如IWP2，或添加与β-catenin降解、Axin稳定相关的抑制剂如IWR1、XAV939来实现的，优选地，是通过添加IWR1来实现的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中的激活WNT信号通路是通过添加WNT信号通路配体如WNT3a，或添加GSK-3抑制剂如CHIR99021、BIO，或添加与Axin有关的激动剂如HLY78来实现的，优选地，是通过添加CHIR99021来实现的。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中的激活成纤维细胞生长因子信号通路是通过添加成纤维细胞生长因子相关辅因子和结合蛋白来实现的，所述相关辅因子如硫酸乙酰肝素蛋白多糖Klotho家族蛋白，优选地，是通过添加硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)来实现的。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中获得的前心外膜细胞是TBX18和WT1双阳性的前心外膜细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤4)中，将步骤3)中获得的前心外膜细胞经过低密度传代来制备心外膜细胞。

9.制备血管平滑肌细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外膜细胞；4)由步骤3)中获得的前心外膜细胞制备心外膜细胞；5)将步骤4)中获得的心外膜细胞用TGFβ1处理；6)将经过步骤5)的细胞用bFGF处理；以及7)将经过步骤6)的细胞再次用TGFβ1处理。

10.通过前述权利要求所述的方法制备的心外膜细胞、血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞。