[发明专利]由干细胞制备心外膜细胞的方法

说明书

本发明提供由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外、膜细胞；以及的由步骤3)中获得的前心外、膜细胞制备心外、膜细胞。本发明还涉及由多能干细胞制备血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞的方法以及通过上述方法制备的心外膜细胞、血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞及其用途。

技术领域

本申请涉及由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，并且还涉及由多能干细胞制备血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞的方法，以及通过上述方法制备的心外膜细胞、血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞及其用途如心外膜细胞用于心脏损伤修复与筛选治疗心脏损伤的新疗法，以及再分化为血管平滑肌细胞用于疾病和药物筛选模型，血管组织工程。

背景技术

心外膜系细胞在胚胎心脏发育过程中是必需的。心外膜细胞的前体细胞：前心外膜细胞，源自脏壁中胚层，在心管的流入道处紧挨心房和静脉窦后部的位置发育。前心外膜细胞的精准来源位置并不十分清楚，然而遗传谱系追踪实验显示前心外膜细胞与心肌细胞共同来自一个心脏形成前体细胞库。在心脏发育的环化阶段，前心外膜细胞向心管方向迁移，并逐渐覆盖整个心脏的表面形成心外膜。此后，一部分的心外膜细胞经过上皮向间充质转化过程侵入到心肌层。这些心外膜来源的细胞进一步分化为血管平滑肌和心脏成纤维细胞。其中血管平滑肌参与构建心脏冠状血管，心脏成纤维细胞主要构建心脏结构。除此之外，心外膜细胞还能通过分泌成纤维细胞生长因子、FGF9、IGF2、FSTL1等因子来促进心肌的增殖、成熟或再生。

在成年哺乳动物心脏中，绝大部分的心外膜细胞不再表达胚胎期的分子标记基因TBX18和WT1。心梗或胸腺素β4注射能够激活这两个基因在成体心外膜和心外膜下层细胞中的再表达，使其活化并分化为平滑肌和成纤维细胞以促使心梗区新血管的生成。此外，有研究显示将人心外膜来源细胞移植到小鼠心梗模型中能够提高发生心梗的小鼠心脏机能和血管再生。除此之外，在小鼠和猪的心梗模型中证明心外膜所分泌的FSTL1能促进成体心肌细胞再生。这些实验表明心外膜细胞，尤其是表达TBX18和WT1的心外膜细胞是治疗心梗的潜在移植细胞来源。

最近世界上有两个利用细胞因子如：FGF2、BMP4、activin A、VEGF和WNT3A以及含动物源成分的培养基来分化WT1+心外膜细胞的方法报道。这两种方法成本高昂，操作复杂，其分化培养基中所含动物源成分不利于所分化心外膜细胞的临床使用和研究。这些缺点阻碍了心外膜细胞的大规模研究及使用。本发明解决了这几个缺点。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提出了利用一种由小分子化合物高效诱导的心肌前体细胞来诱导前心外膜细胞的方法。所述方法包括在干细胞的分化起始阶段利用WNT信号激动剂如CHIR99021来诱导中胚层细胞，而后利用WNT信号通路抑制剂如IWR1来促进心肌前体细胞的形成。在该种分化方法下能得到极高比例的心肌前体细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了利用小分子化合物高效诱导心肌前体细胞为前心外膜细胞的方法。所述方法包括利用成纤维细胞生长因子(硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG))和WNT信号激动剂CHIR99021来协同诱导TBX18和WT1双阳性的前心外膜细胞。还提供了由上述方法产生的前心外膜细胞。进一步提供了包含已分化形成中胚层并经刺激成纤维细胞生长因子和WNT信号通路的外源性试剂处理的干细胞的组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了由多能干细胞生成心外膜细胞的方法。所述方法包括：1)将多能干细胞与试剂CHIR99021接触来诱导中胚层细胞分化；2)经所述试剂CHIR99021诱导的中胚层细胞与另一种试剂IWR1相接触以形成心肌前体细胞；3)已分化形成的心肌前体细胞经硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)和CHIR99021处理，形成TBX18和WT1双阳性的前心外膜样的细胞。4)前心外膜细胞经过低密度传代获得典型的心外膜形态。还提供了由上述方法产生的前心外膜细胞和心外膜细胞。