[发明专利]一种免疫细胞冻存液及冻存方法

说明书

本发明公开了一种免疫细胞冻存液及冻存方法，该冻存液包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖1‑5g/mL、丙二醇3‑6v/v％、乙酰胺3‑5v/v％、右旋糖酐5‑10v/v％、羟乙基淀粉1‑3g/mL、葡萄糖0.5‑1.5g/mL、肝素钠50‑150U/mL、珍珠草提取液5‑15mg/mL和卡介菌复合多糖0.5‑1.5mg/mL。本发明冻存液配方简单，各组分相互配合，协同作用，在提供的冻存方法下可明显提高内皮祖细胞的冻存效果，同时还可保证复苏后细胞增殖活力不受影响，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种免疫细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。

但免疫细胞的体外培养效果很大程度上取决于病人体内的免疫细胞的多少以及质量，但肿瘤病人体内的免疫细胞本来就比正常人少，再加上放疗、化疗后免疫细胞的数量就更为稀少了，因此，采集肿瘤病人体内的免疫细胞往往需要在化疗之前进行，于是就产生了病人放化疗的时间和免疫细胞回输时间的冲突。

如果能够提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，则可解决时间冲突的问题，并且随时抗原使用，对于医生选择治疗方法相当有利。

细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险，因此寻找一种优异的细胞冻存液及冻存过程显得尤为重要。现有的细胞冻存液多采用DMSO联合动物血清，大部分为10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于DMSO含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，而且胎牛血清中含有大量的异种蛋白，既有传染病的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此不能直接用于临床回输。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种免疫细胞冻存液及冻存方法，可有效解决现有技术中细胞冻存液具有一定毒性以及容易引起过敏反应，不能直接用于临床回输的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种免疫细胞冻存液，包括基础培养基和添加成分，其中，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖1-5g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺3-5v/v％、右旋糖酐5-10v/v％、羟乙基淀粉1-3g/mL、葡萄糖0.5-1.5g/mL、肝素钠50-150U/mL、珍珠草提取液5-15mg/mL和卡介菌复合多糖0.5-1.5mg/mL。

进一步地，添加成分包括以下终浓度的组分：海藻糖3g/mL、丙二醇3-6v/v％、乙酰胺4v/v％、右旋糖酐8v/v％、羟乙基淀粉2g/mL、葡萄糖1.0g/mL、肝素钠100U/mL、珍珠草提取液10mg/mL和卡介菌复合多糖0.8mg/mL。

进一步地，珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至80-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-3:1混合，然后进行CO₂超临界萃取，最后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入6-8倍重量的蒸馏水，在90-95℃加热6-8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。

进一步地，卡介菌复合多糖通过以下方法制备得到：将卡介菌接种于苏通液体培养基培养至生长成暗橙色菌膜，然后煮沸2-3h，离心并收集提取液，向沉淀中加入2-3倍无菌水，再煮沸30-50min，离心，合并两次提取液，最后干燥，粉碎，得卡介菌复合多糖。