[发明专利]一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法

说明书

本发明公开了一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法。即从含有人或鼠神经生长因子的溶液中，采用金属离子螯合层析进行分离纯化，得到天然序列神经生长因子；所述金属离子螯合层析树脂由支持介质、螯合配基和金属离子组成；所述金属离子螯合于螯合配基上；所述洗脱的条件为改变蛋白质与金属离子配位结合的竞争性物质浓度梯度。还可以在金属离子螯合层析前，先进行强阳离子交换层析；在金属离子螯合层析后，再进行高效强阳离子交换层析。采用本发明的方法可快速纯化分离天然序列、不带任何蛋白标签的神经生长因子。

技术领域

本发明涉及生物技术纯化领域，尤其涉及一种从混合物中分离天然序列神经生长因子的方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是最早发现的神经系统营养因子，其作用广泛，对中枢和周围神经细胞的生长、发育、分化及再生具有重要作用，其中β亚单位是NGF的活性区。通常所说的β-NGF是118个氨基酸成熟肽。在人体内，β-NGF的表达有下列过程：1.β-NGF编码序列(723bp)翻译为prepro-NGF(241aa)，包括信号肽(1-18aa)、导肽(19-121aa)、成熟肽(122-241aa)；2.内质网上，信号肽被水解，形成pro-NGF，包括导肽与成熟肽。导肽末端有4个氨基酸残基(118-121aa)Arg-Ser-Lys-Arg，为哺乳动物前提蛋白加工酶识别位点，导肽在高尔基体中被前体蛋白加工酶水解，形成NGF(120aa)；3.NGF在7S NGF中γ亚基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽(118aa)。目前商品化的神经生长因子药物为鼠源β-mNGF如(NOBEX)，是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化获得。广泛应用于眼科、神经外科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗。

虽然鼠源神经生长因子(mNGF)与人源神经生长因子(hNGF)具有极高的同源性，但动物源性的蛋白质存在潜在的免疫原性，且生产需要大量的合格的雄性小鼠颌下腺。因此开发基因工程技术重组表达hNGF的制备方法，将是未来NGF药物研发的趋势。在众多表达系统中，相对于原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等，哺乳动物细胞表达系统具有许多优势，例如正确有效的翻译后修饰，使蛋白质能正确得折叠成最接近天然分子的结构；能有效分泌蛋白质至细胞外，且宿主本底表达较低，利于纯化等。

无论是动物组织来源或重组表达的β-NGF，均含有杂蛋白、多聚体、水解误加工形式的β-NGF变体、电荷异构体等不同形式的污染物或β-NGF变体，这些不同形式的β-NGF变体大大影响了β-NGF活性。开发一种将天然118aa序列的β-NGF从这些污染物及错误变体形式中分离出来的方法，是获得高质量重组β-hNGF或动物源β-NGF的关键。

现有市场上的NGF为鼠源且是动物组织提取，存在免疫原性、鼠源病毒等风险。无论是动物组织提取的β-NGF，还是重组表达的β-NGF，都存在有多种变体，比如水解误加工变体、多聚体、电荷异构体。现有的β-NGF纯化技术方案缺点有：难以除去水解误加工变体，产品中存在氨基酸序列截短的NGF；难以除去各种电荷异构体(比如氨基甲酰化、氧化、异天冬氨酸、脱酰胺化等形式)。或者可以制备变体较少的β-NGF，但需要多个层析步骤，例如离子交换层析-疏水作用层析-高效离子交换层析-反向层析，而且反向层析应用到有机试剂，容易使蛋白变性。水解误加工变体，缺失了部分对NGF活性起关键作用的氨基酸残基，大大影响活性。有效去除水解误加工变体可以提高活性。中国专利CN 1268639C中认为疏水作用层析可以去除水解误加工变体。

现有分离提取神经生长因子的技术方法中，存在着难以分离水解误加工变体、电荷异构体的技术难点，分离得到的神经生长因子存在着多种影响活性的变体。抑或为了获得变体含量较少的神经生长因子，需要通过多个层析步骤方才实现，例如通过疏水作用层析、离子交换层析、反向层析等四步层析方法，且反向层析过程中的有机试剂影响活性。