[发明专利]一种高效的外泌体分离方法

说明书

本发明提供一种高效的外泌体分离方法，所述分离方法至少包括以下步骤：（1）向目标细胞中导入带有标签的CD63，培养；（2）离心后取上清液；（3）向上清液中加入磁性体，所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物，孵育；（4）将上清液置于磁场中；（5）去除上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体，并收集。采用本发明所述的收集方法，收集效率高。

技术领域

本发明涉及一种高效的外泌体分离方法，属于生物技术领域。

背景技术

外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～120nm的膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程时发现。又经过多年研究，科学家发现除了网织红细胞以外，T细胞、B细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌外泌体，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。

外泌体中包含多种RNA分子，包括mRNA、miRNA等。但也有少数报道指出，某些特殊来源的外泌体也会包含DNA分子，例如，有研究者发现恶性胶质瘤及星形细胞瘤细胞所释放的外泌体中可能含有线粒体DNA。自2007年首次在外泌体中发现mRNA和miRNA，研究者已在人类及小鼠外泌体中发现了数千个不同mRNA，而且有些转录本只存在于外泌体中，在胞内却无法检测到。这表明，RNA进入外泌体的过程会受到某些特殊的分选机制控制。目前，外泌体RNA分子收录最全的数据库共收录2375个外泌体mRNA和764个miRNA，但是这也仅仅是能够检测到的所有外泌体RNA的一部分，仍旧有大量外泌体RNA的功能未知。

最常见的外泌体蛋白组成包括膜转运和融合相关蛋白(Rab GTPases、Annexins、Flotillin等)、多囊泡胞内体产生相关蛋白(Alix、TSG101等)、热休克蛋白家族(HSP70，HSP90)、整合素和四跨膜蛋白超家族(CD63、CD9、CD81、CD82等)，这些成分反映了其生物起源。蛋白质，如CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix和HSP70常见于大多数外泌体中。

目前，针对外泌体相关的功能学研究越来越多，但是从细胞中分离得到的外泌体时，回收率很低，需要收集大量细胞培养上清，以满足实验需求。另外，目前公认超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。但过程比较费时，且重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。此外，在研究特定细胞分泌的外泌体对其他细胞的功能研究时，通常在感染一段时间后，采用Western blot来验证，不能实时监测。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种外泌体分离方法，用于解决现有技术的不足。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种高效的外泌体分离方法，所述分离方法至少包括以下步骤：

(1)向目标细胞中导入带有标签的CD63，使用细胞培养基进行培养；

所述标签是指可以起到标记蛋白质的物质，可以采用现有技术中的作为标签的物质以及方法。

优选地，所述标签选自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一种或几种。

优选地，所述CD63通过载体携带导入目标细胞；所述载体是指pcDNA3.1。

优选地，向目标细胞中导入带有标签的CD63后培养12～36h后筛选出含有CD63的阳性克隆细胞，再继续培养阳性克隆细胞。所述筛选的方法可以是使用G418抗生素筛选细胞。