[发明专利]一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法

说明书

一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法，属于生物工程领域，该方法首先构建多基因植物表达载体，然后通过根癌农杆菌将其转入到牡丹植株组织中表达并遗传，其中，所述多基因植物表达载体的构建是在pBI1211‑GUS上35S启动子的3’末端引入一个多克隆位点，构建载体pBI121‑35S MCS，再将外源基因WRI1、LEC2和FAD2依次插入到pBI121‑35S MCS中，构建形成多基因植物表达载体pBI121‑WRI1‑LEC2‑FAD2。该方法已构建的多基因植物表达载体为基础，使其能够在牡丹植株中有效表达，收获的牡丹籽能够稳定遗传且含油率高。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法。

背景技术

牡丹是我国特有的传统名花，已有2000多年的栽培历史，栽培品种多达800个以上，牡丹极具观赏、药用、保健等方面价值，尤其是油用牡丹，以其牡丹籽油较高的经济价值和食用、药用价值受到广泛关注，一般油用牡丹籽含油率在27%—33%之间，实践中通常采用传统育种或改变栽培条件来提高牡丹籽的含油率，但这些方法随机性强，且增幅较小，要想较大幅度提高含油量仅依靠传统育种方法通过表型选择十分困难。尤其是面对当前牡丹产业的飞速发展，依靠传统育种技术已远远不能满足规模化种植和生产需要、更难以满足产业化深加工需求。

目前，牡丹在基因功能研究和资源保护、牡丹籽油育种开发等方面的研究基础仍较为薄弱，而含油量又是一种个非常复杂的对基因控制的数量性状，采用基因工程技术来改变牡丹籽油的含油率，必须建立对油分形成和积累的基因调控机制有全面和深入了解的基础，进而利用现代分子生物学技术手段与常规技术相结合才能得以实现，而在此过程中，如何合理且有效的利用已知油料基因，并使其能在牡丹植株中有效表达和稳定遗传是目前面临的一大难题。

WRI1是在拟南芥中发现的一个与种子含油量相关的基因；在植物的胚胎发育过程中，有许多转录因子参与，其中在胚胎发育的中晚期起主要作用的主要有ABI3和LEC类转录因子，LEC2是LEC类转录因子中的其中一种。FAD2基因是油酸去饱和酶的编码基因，是控制油酸向亚油酸转化的关键基因，该基因编码的酶定位于内质网，在亚油酸合成过程中，相位于内质网的单不饱和脂肪酸引入第二个双键，是多不饱和脂肪酸的关键酶。

发明内容

针对上述在提高牡丹籽含油率方面所面临的问题，本发明提供一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法，该方法运用基因工程技术手段，扩增出已知油料基因，构建多基因表达载体并使其能够在牡丹植株中有效表达，收获的牡丹籽能够稳定遗传且含油率高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法，具体包括以下步骤：

步骤一：设计引物，分别扩增3’和5’端均带有酶切位点的WRI1和FAD2基因；在pBI1211载体上引入一个多克隆位点；通过多克隆位点将WRI1和FAD2基因插入到pBI1211载体上，构建多基因植物表达载体pBI121-WRI1 -FAD2；

步骤二、制备感受态根癌农杆菌GV3101，将构建的多基因植物表达载体进行根癌农杆菌的转化，验证正确后获取阳性根癌农杆菌；无菌条件下将阳性根癌农杆菌培养至对数期，形成浸染液，备用；