[发明专利]一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎率发生的方法

权利要求书

1.一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于主要包括以下步骤:

(1)选取结球甘蓝、芥菜、小白菜处于单核晚期至双核早期阶段的干净无污染花蕾,将花蕾保湿置于4℃处理1-3d备用；花蕾灭菌消毒用体积比75%酒精消毒60s，质量比8%的次氯酸钠溶液表面消毒20min,无菌水冲洗5次；

(2)将20-25个无菌结球甘蓝花蕾置于无菌烧杯中,加入15-20ml pH6.0 NLN-13液体培养基,采用挤压法游离小孢子,然后用450目尼龙网过滤,将滤液收集于离心管,1000r.min^-1离心5min,弃上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0 NLN-13液体培养基,调整小孢子密度为1.5×10⁵~2×10⁵个ml^-1,并加入100µl的活性炭混合液,分装到15-20个直径为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中,每培养皿3-4ml;

(3)剥取无菌芥菜、小白菜花蕾,取出完整花药加入到步骤(2)中的培养皿中,芥菜、小白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为3:3:1～5:5:1,加盖后封口;

(4)将步骤(3)中得到的加盖封口的培养皿置于32.5℃恒温培养箱热激处理24h,再转移到25℃条件下静置黑暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现后,置于摇床70-80rpm、25℃黑暗培养胚状体发育到成熟的子叶型胚状体；

(5)无菌条件下,将步骤(4)中得到的成熟的子叶型胚状体转接至胚状体分化培养基B5培养基中,18 h.d^-1、5000Lx，24±1℃条件下培养18-20天至形成愈伤组织或直至分化出芽，再按大小将愈伤组织切成3-5块置于生根培养基中生根培养形成再生植株, 生根培养的条件为25℃、5000Lx、16h.d^-1;

(6)步骤(5)中得到的再生株长到含4-5片叶的健壮苗时,在培养室内开瓶炼苗,驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中,于25℃下12h光照和12h黑暗交替静值培养,1周后营养钵放置外界阴凉处,逐步炼苗,3周后将其移栽到大田,获得植株；经倍性鉴定后,获得的纯合双单倍体再生植株用于育种。

2.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述结球甘蓝的花瓣和花药长度比为0.5-1.0，芥菜的花瓣和花药长度比为0.4-0.8，小白菜的花瓣和花药长度比为0.6-0.9。

3.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，在步骤（1）前分别进行周年采集结球甘蓝、芥菜、小白菜花蕾供小孢子培养。

4.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述NLN-13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、蔗糖125-130g，0.05 mg 6-BA,15mg AgNO₃和0.05 mg 2,4-D；pH为5.8-6.2。

5.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述活性炭混合液的组成为:NLN液体培养基1L、琼脂糖6-10g、活性炭4-6g。