[发明专利]一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎率发生的方法

说明书

本发明公开了一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,将芥菜、小白菜无菌花药与结球甘蓝小孢子混合悬浮液共同培养,培养得到的胚状体在初期即可确定是结球甘蓝的胚状体,因为结球甘蓝小孢子是游离状态的,而芥菜、小白菜小孢子在花药中,因此在再生植株移栽时不需要对小孢子植株群体的芥菜、小白菜植株进行区别鉴定,从而减少了工作量,从而提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子出胚效率。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域,尤其涉及一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的培养方法。

背景技术

结球甘蓝(Brassica oleacea L.var.cap itata L.)是十字花科芸薹属植物的一个变种，起源于地中海沿岸，16世纪开始传入中国。结球甘蓝具有抗病、适应性强、易贮耐运、产量高、品质好等特点，由于其适应性广及抗逆性强，稳产，又耐贮运，因此在我国栽培发展很快，目前每年种植面积已达300万hm²以上，在蔬菜周年供应及出口贸易中都占有重要地位。

目前,我国生产所用的结球甘蓝种子主要靠进口,价格昂贵。选育具有自主知识产权的结球甘蓝品种,是急待解决的问题。结球甘蓝属于绿体春化型植物,两年才能完成一个生活周期,加代繁殖十分困难。从一个杂合基因型材料起步,培育一个可用于商业制种的杂交种亲本自交系,至少需要6-8年时间。结球甘蓝最适宜采用单倍体育种途径加快新品种选育进程,游离小孢子培养是十字花科芸薹属作物近年来被开发的一条单倍体育种的有效途径。

Lichter(1982)在甘蓝油菜上首创的单细胞培养技术,目前已经应用于多种甘蓝类植物的单倍体育种。Lichter(1989)和Takahata et.al(1990)在结球甘蓝和花椰菜的游离小孢子培养研究中获得了再生植株。冯辉(2007)等利用自己构建的结球甘蓝游离小孢子培养体系,首次获得了结球甘蓝双单倍体植株。目前,该技术在结球甘蓝上的应用还不够成熟,受基因型等很多因素的影响较大,许多品种难以获得胚状体及再生植株,限制了该项技术在育种实践中应用的步伐。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,采用结球甘蓝低出胚基因型游离小孢子与易出胚的芥菜、小白菜花药共培养,获得的结球甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数较对照大幅度提高,且胚状体的质量也得到很大改善,从而提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子出胚效率。

本发明提供了一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法，主要包括以下步骤:

(1)选取结球甘蓝、芥菜、小白菜处于单核晚期至双核早期阶段的干净无污染花蕾,将花蕾保湿置于4℃处理1-3d备用；花蕾灭菌消毒用体积比75％酒精消毒60s，质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒20min,无菌水冲洗5次；

(2)将20-25个无菌结球甘蓝花蕾置于无菌烧杯中,加入15-20ml pH6.0NLN-13液体培养基,采用挤压法游离小孢子,然后用450目尼龙网过滤,将滤液收集于离心管,1000r.min^-1离心5min,弃上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0NLN-13液体培养基,调整小孢子密度为1.5×10⁵～2×10⁵个ml^-1,并加入100μl的活性炭混合液,分装到15-20个直径为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中,每培养皿3-4ml；

(3)剥取无菌芥菜、小白菜花蕾,取出完整花药加入到步骤(2)中的培养皿中,芥菜、小白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为3:3:1～5:5:1,加盖后封口；

(4)将步骤(3)中得到的加盖封口的培养皿置于32.5℃恒温培养箱热激处理24h,再转移到25℃条件下静置黑暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现后,置于摇床70-80rpm、25℃黑暗培养胚状体发育到成熟的子叶型胚状体；