[发明专利]中枢记忆性T细胞体及其外培养方法

说明书

本发明公开了一种中枢记忆性T淋巴细胞的体外培养方法，该方法包括以下在初始培养基中加入有IL‑21，培养环境中氧气浓度为1±0.1％；在培养第7天时，再扩增培养基中加入有IL‑21和雷帕霉素。本发明首次公开了在恰当的培养过程中，应用雷帕霉素、白介素21和低氧环境，三者联合，可以提高中枢记忆性T细胞比例、抑制其向效应细胞分化、增加其对肿瘤细胞的杀伤作用的体外培养扩增方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种中枢记忆性T淋巴细胞及其体外培养方法。

背景技术

过继性免疫细胞治疗是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。过继性免疫细胞治疗是当前肿瘤免疫治疗中新兴的、具有显著疗效的一种治疗手段。其中，T细胞过继免疫治疗是现在国际上应用的最广泛效果最显著的免疫治疗手段，其作用原理是利用体外扩增激活的特异性T细胞实施对抗原的杀伤功能。

特异性T细胞主要分为两种，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。在细胞过继免疫治疗中，CD4⁺T细胞除了自身具有杀伤能力外，更可以辅助机体自身的免疫细胞以及共过继的免疫细胞，具有很强的泛用性，并能与CD8⁺T细胞相互补充。CD4⁺T淋巴细胞可以分为三个亚群，初始T淋巴细胞、效应性T淋巴细胞以及记忆性T淋巴细胞。记忆性T细胞根据是否表达归巢受体CCR7和CD62L分为中枢记忆性T细胞(central memory T cell，TCM)和效应记忆性T细胞(effector memory T cell，TEM)。TCM细胞表达CCR7和CD62L，主要分布于淋巴结和扁桃体等，TEM主要分布在外周组织中。TEM细胞在体内存活寿命短，虽然有一定的清除效果，但无法达到长期治疗的效果，而TCM细胞则可以在体内维持自我更新，产生持久的杀伤效果，在免疫治疗中得到越来越多的重视。

TCM细胞在现在国际顶尖的免疫细胞治疗技术中常常作为基因工程的种子细胞进行修饰加工，增强其杀伤肿瘤细胞的能力。比如使用嵌合抗原受体技术(CAR-T)或T细胞受体(TCR-T)技术修饰TCM细胞，便可以获得杀伤性和持久性都很高的新型免疫细胞，进而应用于恶性肿瘤的治疗。

TCM在机体内的比例和数量较少，且随着体外扩增的进行，TCM极易变成终末分化的效应细胞。因此如何在体外获得高纯度、高活性和较高扩增能力的TCM细胞是细胞免疫治疗的一个热点，也是免疫治疗临床应用所急需解决的一个难题。

发明内容

为解决中枢记忆性T细胞体外扩增纯度低和较易转化为效应细胞的问题，本发明目的之一是提供了一种中枢记忆性T细胞的体外培养方法，该方法提高了中枢记忆性T细胞比例和功能性。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种中枢记忆性T淋巴细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

在细胞培养板中，包被CD3抗体；

加入初始培养基和分选出来的T细胞进行培养，培养环境中氧气浓度为1±0.1％；初始培养基中加入有IL-21；

继续培养，每隔两天补充初始培养基；

第6天时，吸取细胞到离心管中，离心，去上清，用初始培养基重悬，然后转移到细胞培养板中继续培养；

第7天时，取培养瓶，包被CD3抗体；将T细胞转移到离心管中，离心，去上清，用再扩增培养基重悬，然后转移到T25培养瓶中继续培养；所述再扩增培养基中加入有IL-21和雷帕霉素；

继续培养，每隔两天补充再扩增培养基，培养到第14收获中枢记忆性T淋巴细胞细胞。

在其中一个实施例中，所述基础培养基为AIM V培养基。

在其中一个实施例中，再扩增培养基中所述雷帕霉素的浓度为5-30ng/ml。